このプロトコルは、適応可能な管理レポーターを使用して、スプライシング効率を監視するための細胞アッセイを記述します。このレポーターアッセイは、エクソンまたはスプライス部位における疾患関連変異の影響を研究し、5点スプライス部位への変異体の認識を改善するための治療、特に1つの粒子を設計するために使用することができる。Hela細胞での継代は、使用済み培地を吸引し、1ミリモルのEDTAを含む中で0.2 5%トリップの3ミリリットルで細胞を摂氏37度で3分間インキュベートする。
7ミリリットルの新鮮なDMEMでインキュベートした後、細胞懸濁液を10ミリリットルのチューブに移した。細胞を遠心分離する。次いで、細胞ペレットを10ミリリットルの新鮮なDMEMに再懸濁し、一過性トランスフェクションのために、20%コンフルエントで新しい組織培養皿上に細胞をプレートする。
きれいな血液細胞計スライドでヘラ細胞を数え、1ミリリットルあたり10〜5番目の細胞に2.5倍の密度の懸濁液を調製し、1ミリリットルの細胞懸濁液を12ウェルプレートの各ウェルにシードし、摂氏37度で一晩インキュベートする。翌日、使用済み培地を吸引し、血清を含む800マイクロリットルの新鮮なDMEMをプレートに加える。トランスフェクションミックスを準備し、それらを15秒間渦巻きます。
その後、混合物を遠心分離し、室温で5分間インキュベートする。インキュベーション後、トランスフェクションミックスの200マイクロリットルすべてを12ウェルヘラ細胞プレートの1ウェルに加え、ウェルあたり1ミリリットルの最終容量を達成し、プレートを摂氏37度で48時間インキュベートします。調製した標識化反応をインキュベートする。
分画サイズの25キロダルトン分子量排除ビーズを10秒間穏やかにボルテックスすることによって再懸濁する。次に、再懸濁ビーズ600マイクロリットルを使い捨てミニカラムに移し、1.5ミリリットルの収集チューブに入れ、ビーズストックを摂氏4度に戻した。カラムを遠心分離し、カラムを通る流れを捨てます。
次いで、カラムに300マイクロリットルのRNA遊離水を加えてビーズを2回洗浄する。2回目の洗浄後、ミニカラムを新しい1.5ミリリットルの遠沈管に移し、キナーゼ反応ミックスをカラムに加えます。カラムを遠心分離し、P32標識オリゴヌクレオチドを含むフロースルーを回収する。
ヘリ細胞から抽出した2マイクログラムのRNAを200マイクロリットルのマイクロ遠心管に加え、RNA遊離水を加えて体積を6.55マイクロリットルにする。次に、RNAサンプルを含む各PCRチューブにマスターミックスを1本ずつ0.9マイクロリットル加え、まずチューブを摂氏65度で5分間、次に氷上で1分間インキュベートします。次に2.55マイクロリットルで、マスターミックス2本、RNA及びマスターミックス1本を含む各チューブに対し、チューブを室温で10分間インキュベートした。
インキュベーション後、チューブをサーマルサイクラーに移し、まず摂氏50度で60分間、次に摂氏70度で15分間インキュベートする。インキュベーション後、各サンプルに10マイクロリットルの2倍ホルムアミドRNAローディング色素を添加し、UIAページによってフラグメントを分離する作業に進む。パーシーDNA合成。
形質移入ヘラ細胞から抽出した2マイクログラムのRNAを200マイクロリットルのマイクロンシマウジターチューブに加え、RNAの自由水を加えて体積を11マイクロリットル以下にする。次に、2マイクロリットルを加え、マスターミックスを各サンプルに1つずつ加え、まず摂氏65度で5分間、次に氷上で1分間インキュベートする。次に、7マイクロリットルを加え、マスターミックスを各チューブに2本ずつ加え、チューブを室温で10分間インキュベートし、続いて摂氏50度で60分間、摂氏70度で15分間インキュベートした。
次に、PCRのためにC DNA反応を希釈して1マイクロリットルあたり100ナノグラムの濃度を得、各cDNAサンプルの1マイクロリットルを新しいPCRチューブに移した。CDNAを含む各チューブに10.5マイクロリットルのマスターミックスを加え、PCRを行う。PCRが完了したらサーモサイクラーを使用した。
12.5マイクロリットルの2倍ホルムアミドDNAローディング色素を各チューブに加える。サンプルを摂氏 95 度で 5 分間加熱し、UIA ページの実行に進みます。5マイクロリットルの希釈CDNAを96ウェルqpcrプレートの個々のウェルに3連のピペットで移す。
次に、各ウェルに10マイクロリットルのリアルタイムPCRミックスを加え、プレートを光学フィルムで密封し、遠心分離機でウェルの底部への反応を収集し、次いで標的アンプリコンの閾値定量サイクル値を収集しながらqpcrを行う。マーカーとサンプルをロードする前に、TBEバッファーでウェルを洗い流し、落ち着いた尿素を除去します。次いで、ウェル当たり各サンプルの10マイクロリットルをロードし、ゲルを300〜500ボルトで2〜3時間、またはキシレンが底に達するまで実行した。
電気泳動後、電気泳動装置からガラス板を取り出し、ゲルがいずれかのガラス表面に平らになるように2枚のプレートを慎重に分離し、次いでゲルを濾紙上に移し、プラスチックラップで覆い、ゲル乾燥機を用いてゲルを摂氏80度で30分間真空乾燥させ、 次いで、乾燥ゲルを蛍光体画像化カセット中に置き、室温で一晩インキュベーションする。ヘラ細胞で発現させると、スライスレポーターdup 51ミニジャンは、エクソン2が効率的にスプライシングされた成熟全長転写産物を発現する。5つのプライムスプライス部位変異およびdup 51Pは、エクソン2つの包含を95%から30%に減少させ、より短い転写産物の形成をもたらす。
U15A SNRNAとのdup 51 Pの共発現は、エクソンの2つのスプライシングを救助し、そして全長転写産物の形成を回復させる。対照的に、野生型U1またはU15G変異体との共発現は、dup 51Pスプライシングに対して同様の効果を有しない。U15A変異体転写産物の検出は、一次拡張により、U1 SNRNAの第5位のアデニンに近い20ヌクレオチド長および塩基対である7〜26個のオリゴヌクレオチドのU1を使用する。
DATP単独の存在下で、U1 7〜26は、内因性の野生型U1 SNRNAに対して2〜3ヌクレオチドを組み込むことを可能にする、22または23ヌクレオチド長の産物を生じる。U15AおよびU15G変異体の場合、伸長は単一のアデノシンを付加した後に終了し、21ヌクレオチド産物を産生する。U2 SNRNA発現への正規化後、トランスフェクトされたU1野生型U1 5gおよびU15A変異体は、内因性SNRNAにわたって3〜5倍で発現した。
抽出されたRNAの品質は、スプライシング分析にとって非常に重要です。したがって、RNAフリーウォーターの使用、およびRNA不活性化剤によるサービスの除染を強く推奨する。ここで説明する報告システムは、改変型U1SN RNAを用いた遺伝子サイレンシングに対するフラッシュプライススプライシング変異の逆転効果に対するスプライシング規制におけるU1 SN RNAの役割の研究に応用することができる。
