次の方法の記事の全体的な目標は、共焦点顕微鏡と結合された光ピンセットを用いて、タンパク質または他の因子とのRNA相互作用を研究するのに有用なプロトコルを実証することです。過去10年間で、単一の高分子の特性を調べるためのいくつかの洗練された技術が開発されました。これらの技術の1つは、単一分子光ピンセットである。
新しい蛍光支援光ピンセットを使用すると、RNA分子の展開に必要な力だけでなく、翻訳中の結合事象も詳細に監視できます。ここでは、RNA分子が翻訳を調節する取引因子の有無にかかわらず伸ばされる測定に焦点を当てます。また、ラベル付きリボソームを用いた翻訳を監視する方法についても説明します。
このプロトコルは、私のグループの2人の大学院生、ルーカス・ペカレクとステファン・パークによって実証されます。このビデオでは、光ピンセット実験のセットアップと実行について説明します。また、単純なデータ分析ワークフローの概要も説明します。
この手法の利点は、簡単で堅牢な方法です。分子は2つのビーズの間につながれ、レーザービームの焦点に縛られ、変位時の変化と力は、いわゆるフォースランプ実験で正確に測定することができます。テザー内部の二次構造は、分子の内部エネルギーに応じてある程度の力で展開します。
複数の構造間のこの動的な遷移は、一定の力の測定によってさらに調査することができる。さらに、蛍光イメージングの並列使用により、結合事象をリアルタイムで可視化することができます。テザーの明確な力距離プロファイルは、安定性に影響を与える潜在的な取引因子の結合後に変化する可能性があります。
まず、目的のRNAをDNAベクターにクローン化する必要があります。この配列の上流および下流では、追加の部品、ハンドルがビーズ間の最終的なDNA-RNA構築物をテザーするために必要である。プラスミドのクローニングと増幅が成功した後、3つの異なるPCR反応が行われます。
PCR反応ごとに、プロトコルの表1に従って試薬を混合します。適切なサーマルサイクラーで50マイクロリットルのアリコートでPCRを実行します。最初の1つは、その後のインビトロ転写のためのT7プロモーターを有する全構築物の二本鎖DNAをもたらす。
2 番目の PCR では、5 つの素数ハンドルが生成されます。一方、最後の反応は3つの素数ハンドルで生じる。5素数および3素数ハンドルの両方が使用されるビーズに従ってラベル付けする必要があります。
3つの素数ハンドルは、ジゴキシゲニン標識リバースプライマーを使用してPCR中に標識され、5つの素数ハンドルはビオチン化を通して余分なステップでラベル付けする必要があります。5つの素数ハンドルの3つのプライムビオチン化は、T40およびポリメラーゼを用いて行われる。反応は室温で1〜2時間行う。
次に、T7ポリメラーゼを用いてインビトロ転写を行う。RNAの長さに応じて、反応を37度から4時間インキュベートします。最後の1つのステップでは、ハンドルは、二本鎖ハンドル間の関心のある単一鎖領域を有する最終的なDNARNA構築物を得るために、インビトロ転写からRNAでアニールされます。
目的のRNA-DNAハイブリッドをアニールするには、ハンドルとRNAをアニーリングバッファーに混ぜます。熱、焼鈍混合物を85度まで10分間加熱し、サンプルをゆっくりと4度に冷却する。アニールサンプルを酢酸臼歯3ナトリウムの1/10体積と、氷冷エタノール3ボリュームと混合し、少なくとも1時間はマイナス80度のインキュベートを行います。
サンプルを15,000 xgで4度で30分間遠心する。上清を捨て、ペレットを真空下で乾燥させます。再懸濁されたペレットの小さなアリコートは液体窒素で凍結され、使用されるまでマイナス80度に保たれる。
まず注射器から漂白剤を取り出し、RNaseフリーウォーターの1mLを埋めます。0.5モルナトリウムチオ硫酸ナトリウムの50マイクロリットルを追加し、1つのバーでシステムを洗います。マイクロ流体システムは、システム内の気泡を避けるために、乾燥して実行することはありません注意してください。
次に、残りのチオ硫酸ナトリウム溶液を廃棄し、注射器を新しいものに交換します。その後、RNaseフリー水の少なくとも0.5mLで再び洗浄します。機械の光学系をセットアップするには、目的に浸漬油を2滴入れます。
フローセルを所定の位置に置き、液体がフローセルに触れるまで目的を上げます。その後、フローセルの上に浸漬油を2滴入れます。トラップステアリングユニットとトラッピングレーザーをオンにします。
目的は、マシンの診断カメラのZファインダーツールを使用して調整されます。マイクロスクリューを回すことで、Z軸は第2と第3の反射の間のチャンバの中央に調節される。屈折リングが最大である場所。
診断カメラをムーンモードに切り替え、トラップレーザーを約50%に減らしてから、凝縮器を下げ、約10個の光バンドが見える位置を調整します。測定室には5つのチャネルがあり、実験の前に、異なるセットアップの可能性を考慮する必要があります。単純なフォースランプ実験では、ビーズバッファビーズは便利なチャネル配置です。
蛍光リボソームや取引因子などの第4化合物を用いた測定では、ビーズ緩衝因子はより良い配置ですが、ビーズを捕まえるのが難しくなります。アニール構造のアリコートは、3マイクロリットルADビーズ懸濁液、1マイクロリットルRNase阻害剤、および8マイクロリットルのアッセイバッファーを室温で10〜20分間インキュベートする。次いで、サンプルを500マイクロリットルアッセイバッファーで希釈し、それぞれのチャネルに入れます。
第2種のビーズについては、0.8マイクロリットルのアッセイビーズをアッセイバッファーの1 mLと混合し、対応するチャネルに投与する。チャネルは開かれ、低い圧力で洗浄される。今、トラップレーザーをオンにします。
ビーズをキャッチするには、レーザーが互いに離れて移動し、ADビーズがトラップ1に巻き込まれる。次に、ステージは SA ビーズ チャネルに移動し、ビードはトラップ 2 に捕らえます。ビーズを失うことを避けるため、または同じトラップで 2 つ目のビードをキャッチするために、ステージはバッファー チャネルに移動され、すべてのチャネルが閉じられます。
バッファ内では、トラップキャリブレーションが実行されます。キャッチビードは、後続の測定のための視覚的なテンプレートとして設定する必要があります。類似性スコアは、比較可能性を保証するために、測定値間で90%以上に保つ必要があります。
最後に、ビーズを近づけて、1つのテザーを捕まえることができます。これは、数秒間ビーズを近くに移動し、ゆっくりと再びビーズを出発します。テザー形成は、2つのビーズを互いに引き離した場合に測定力の増加をもたらす。
テザーの数と品質は、伸縮高原を見つけ、軌道を自由に関節鎖またはワーム状の鎖モデルと比較することによって確認することができる。過延伸高原は、単一のテザーに対して50〜60ピコニュートンの間でなければなりません。蛍光測定を行うためには、ユニットと光ピンセットマシンの共焦点レーザーと光子数をオンにします。
その後、所望の波長とソフトウェアインターフェースの励起レーザーをオンにし、蛍光色素に応じてレーザーのパワーを5%以上に設定します。ソフトウェアの画像または動体機能を使用してイメージングを開始できるようになりました。焦点を合わせた画像を得るためには、共焦点顕微鏡と光学トラップの焦点面が揃っていることを確認してください。
この目的のために、青色レーザーチャネルにおけるポリスチレンビーズの自己蛍光を採用することができる。ビーズの自己蛍光が最高径になるまで、光トラップの焦点面で上下に移動します。この位置では、テザーリングされた分子で起こる蛍光信号を検出することができます。
どちらの機能でも、適切な領域を選択することが重要です。測定バッファー組成物全体を通して、ビーズを異なるチャネルに移動するか、マイクロ流体システムで供給されるバッファーを変更することによって容易に変更できます。光の消光を避けるために、測定しない場合は必ず励起レーザーをオフにしてください。
デバイスからの生データ出力には、多くの場合、多くのノイズが含まれています。したがって、散乱データをさらに解析するために、まずそれらを事前処理する必要があります。最初のステップは、ローパスバターワースフィルターでデータをダウンサンプルしてフィルタリングし、良好な結果が得られた。
フォースランプ実験では、最初の距離曲線の折り畳まれた展開された領域で展開イベントをマークする必要があり、ワームのようなチェーンまたは自由にジョイントされたチェーンモデルを使用して取り付けることができます。一定力データでは、時間の経過に対する距離をプロットすることができ、特定の力で優勢な立体構造を定量化するためにヒストグラムを生成することが有用です。ここでは、フィルタパラメータが異なる折りたたみ状態を区別するために重要であることを示しています。
この手法で何が達成できるかをより深く理解するために、いくつかの代表的な結果が示されています。これは、フォースランプ実験からの標準的な力距離曲線がどのように見えるかです。この場合、SARS-コロナウイルス-2フレームシフトエレメントを研究した。
我々は、15ピコニュートンの周りの複数のステップで展開を観察した。方向が反転し、ビーズが再び近づいているとき、テザーはわずかに低い力で折り返します。ジンクフィンガー抗ウイルスタンパク質ZAPの存在下で同じRNAを測定した場合、同様の展開パターンが観察された。
しかし、RNAの二次構造は再折り畳み出さなかった。これは、タンパク質結合がRNAキネティクスにどのような大きな影響を与えることができるかを示す良い例です。一定の力のデータを見ると、展開するキネティクスをさらに調査することができます。
時間経過に対する距離は異なる力に対してプロットされ、異なる観測状態のヒストグラムが右側に追加されます。10ピコニュートンでは、RNAは完全に折り畳まれた状態にある。11.5ピコニュートンでは状態間を切り替え、13ピコニュートンではRNAは永久に展開された状態にある。
しかし、SARS-コロナウイルス-2フレームシフトエレメントをZAPと一緒に測定すると、RNAは11ピコニュートンで完全に展開状態にあり、10ピコニュートンで折り畳まれた状態に向かってほとんど移行を示さなかった。これは、ZAP が単一のフレームシフト要素に結合し、二次構造の形成を防止することを示します。最後に、光ピンセットデータと共焦点顕微鏡を組み合わせたものを見ていい。
本実験では、二本鎖核酸に標識する蛍光色素を用いたが、特に増加力を伴う。キモグラフは、ビーズが互いに離れて移動するにつれて、蛍光強度が増加し、テザーが伸び過ぎて壊れると完全に消失することを示しています。最後の図では、蛍光標識リボソームをチャネル4を介して添加した。
本実験では、RNAテザーに特異的にリボソーム結合が認められた。このビデオが光ピンセットとこの信じられないほどのテクニックを実行できるものについての洞察を与えた願っています。
