細胞内FPOPと質量分析法を組み合わせることで、生きた細胞におけるタンパク質相互作用とタンパク質構造変化を研究するために使用される強力な新しい技術です。細胞内FPOPを使用すると、関心のあるタンパク質を分離する必要はありませんが、むしろネイティブ環境でそれらを研究することができます。これは膜タンパク質に特に役立ちます。
この方法を用いれば、がんや遺伝性疾患など様々な疾患における構造やタンパク質相互作用の変化を研究できるため、それらをより深く理解し、特徴付けることができます。流れシステムの組み立てを開始するには、切断石を使用して、融合したシリカチューブを適切なサイズに切断します。次に、1つの500マイクロリットルシリンジに6つの小さな円筒形の磁石を入れ、シリンジ、2番目の500マイクロリットルシリンジ、シースバッファー付きの2つの5ミリリットルの注射器を充填します。
空気を取り除いた後、シリンジポンプに注射器を置き、モーターが失速したときに細胞シリンジが約50マイクロリットル残るように、シリンジポンプストッパーを締めます。ルアーアダプターを使用して、手動バルブを各シリンジに接続し、図示したようにシリカチューブを組み立て、セルと過酸化水素シリカラインを十字を通して、それを450 IDシリカラインに直接挿入します。すべてのチューブが接続されたら、フローシステムをレーザーの隣に配置し、ライターを使用して450マイクロメートルの内径チューブのシリカコーティングを燃やしてレーザー照射用の窓を作ります。
6つの磁石を含むセルシリンジの上に磁気攪拌機を置き、1分間に1083.3マイクロリットルの最終流量のために、シリンジポンプを毎分492.4マイクロリットルに設定します。システムを 3 回フロー バッファでシステムをフラッシュし、各接続でリークがないかチェックします。凸レンズを使用して、エキシマレーザーをシリカチューブに焦点を合わせます。
照射窓をテストするには、シリカチューブの後ろに小さな紙を置き、レーザーをオンにします。次に、照射から焼けた領域を測定し、照射窓と流量を用いて必要なレーザー周波数を算出し、ゼロの排除分率を得る。処置のための細胞を収集するために、適切な細胞培養グレードの塩溶液で70〜90%コンフルエントT175フラスコ培養から細胞を洗浄する。
カウント用のバッファーの 10 ミリリットルで細胞を再中断し、遠心分離によって細胞を収集します。.下流の分析に十分なセルをカウントすることは重要ですが、フロー システムを集約して詰まらせるには多すぎないようにします。次いで、シースバッファー濃度のミリリットル当たり6番目の細胞に2倍10で細胞を再懸濁し、サンプルあたり1500マイクロリットルの体積に細胞をアリコートする。
インセルFPOPの場合は、新鮮なシースバッファー、磁石を含む500マイクロリットルのシリンジに1つのアリコートを含み、最後の500マイクロリットルシリンジに新たに調製した200ミリモル過酸化水素を充填します。220マイクロリットルのジメチルスルホキシドを磁性攪拌機とスパイクをクエンチの1つのアリコートに入れます。穏やかな混合の後、流れシステムの後ろにクエンチを置き、照射されたサンプルを収集し、レーザーをオンにします。
7 秒後、フロー システムの電源を入れます。サンプルの流れが終了したら、レーザーをオフにして、収集したサンプルとクエンチを軽く混ぜます。次に、4つのシリンジすべてをフレッシュバッファで満たし、フローシステムを介してバッファをフラッシュします。
システムがフラッシュを終了した後、細胞内のバックグラウンド酸化を考慮して、レーザーコントロールを照射せずに細胞と溶液の新しいアリコートで手順を繰り返します。次のサンプルが実行中の間、最初のサンプルを遠心分離し、適切な細胞のライシスバッファーの100マイクロリットルでペレットを再懸濁します。次いで、液体窒素中のフラッシュ凍結のためにマイクロ遠心チューブにサンプルを移す。
すべてのサンプルが実行を終了したら、流れシステムを分解し、使用したシリカチューブを廃棄します。次に、50%の水50%メタノール溶液で1時間の超音波処理によって他のすべての接続をきれいにします。標準的なプロトコルに従って細胞ライセートからタンパク質を分離して消化した後、標準的なタンデムLCMSプロトコルに従って消化された細胞ライセートを分析し、FPOP修飾プロチウム全体を局地化する。
次に、適切なタンパク質分析ソフトウェアプログラムにデータをロードし、関連するタンパク質データベースおよび関連する消化酵素に対してデータを分析します。ファイルの検索が終了したら、目的のタンパク質に対する FPOP 酸化の程度を計算します。直交YZ積層画像の蛍光画像は、レーザー照射窓を通過する際の細胞溶液からのシースバッファーの明確な分離を示す。
シースバッファーまたはセル溶液の3次元平均ヒートマップは、2つの溶液の最小混合を例示するために生成され得る。単一細胞流動システムの使用により、酸化的に改変されたタンパク質の数が13倍に増加する。インタクトな細胞内の目的とするタンパク質の修飾を確認するために、蛍光イメージングは、過酸化水素処理および照射後に行うことができる。
タンデム質量分析を使用して、これらの修飾は、タンパク質上の特定のアミノ酸にさらに局在させることができる。この抽出されたイオンクロマトグラムで観察されたシフトは、改変ペプチド中の酸化メチオニンによって引き起こされる疎水性の変化に変換されます。インビトロフットプリントによってインセル標識アクチンを比較すると、同様のレベルの酸化が明らかになっており、アクチンは細胞内およびインビトロの両方の研究に対して同様の溶媒アクセシビリティを有することを示している。
また、目的タンパク質の高速光化学酸化の程度を溶媒アクセシビリティに比較し、2つのアクチン結晶構造から計算した標識残基は、目的のタンパク質の細胞内高速光化学酸化を効率的にプローブすることを示す単量タンパク質の溶媒アクセシビリティを示す。2Dクロマトグラフィー、細胞内分画、プロテオミクス多重化技術など、より低い豊富なFPOP修飾の検出を増加させるために取ることができるいくつかの追加のステップがあります。細胞内FPOPを用いれば、プロテオム構造生物学を行い、タンパク質構造と細胞機能をより良く結び付けることができます。
FPOPに必要な248ナノメートルの波長のため、反射または散乱放射線への意図しない暴露を避けるために、UV保護ゴーグルと適切な衣服を着用してください。
