この方法は、植物病原体によって分泌されるRNAサイレンシングサプレッサーをスクリーニングする方法に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、RNAサイレンシングサプレッサー同定のための迅速で正確かつ広範なスクリーニングアッセイを提供することです。50%の泥炭苔、30%パーライト、20%のバーミクーライトとオートクレーブからなるポット土壌ミックスを摂氏120度で20分間準備します。
オートクレーブ土壌を植物肥料溶液と1リットル当たり1グラムで浸し、より大きなトレイに保存された小さなポットにサブパッケージします。ニコティアナベタミアナ16cの1つまたは2つの種子を各鍋の土壌表面にまきます。トレイにプラスチック製のドームを覆い、種子を発芽させます。
温度が23~25°C、相対湿度50~60%、長い日光周期で、軽くて温度制御された成長室の下にトレイを置きます。3~4日後、種子は発芽する。プラスチックドームを取り除き、苗が発芽ステップに使用されるのと同じ条件下で成長できるようにします。
2~3日ごとに、土壌を湿らせたまま、浸かないように適切な量の水を加えます。10日ごとに、肥料を加えるので、さらなる成長を促進します。植物が目に見える腋窩や花の芽を持たない少なくとも5つの完全に発達した真の葉を持ち、葉が健康的な緑色の外観を持つまで、通常の条件下でニコチアナベタミアナ16c植物を維持します。
全身性RNAサイレンシングアッセイには10〜14日前のニコティアナ・ベサミアナ16c植物を使用し、ニコティアナ・ベタミアナ16cの3〜4週齢の葉を地元のRNAサイレンシングアッセイに使用します。先端を使用してLBプレートから正のコロニーを選び、5ミリリットルのLB培地を含むガラス管に細胞を接種し、1ミリリットルカナマイシンあたり50マイクログラム、1ミリリットルリファンピシンあたり50マイクログラムを添加します。200 RPMで24~48時間揺れ、30°Cで細胞を成長させます。
同じ抗生物質を添加したLB培地の5ミリリットル、pH 5.6で10ミリモルMES、および20マイクロモルASに培養物の100マイクロリットルを移す。200 RPMで16~20時間振ると、30°Cで細菌を成長させます。細胞を4,000回gで10分間遠心分離する。上清を捨て、10ミリモル塩化マグネシウムバッファーの2ミリリットルでペレットを再懸濁します。
洗浄を繰り返して、抗生物質を完全に除去します。600ナノメートルで光学密度を測定することにより、アグロバクテリウム培養の密度を決定します。10 ミリモル塩化マグネシウム バッファーを使用して細胞培養を 1.5 ~ 2.0 の OD 600 に調整します。
最終的な懸濁液培養物にpH 5.6および150マイクロモルASで10ミリモルMESを加え、揺れることなく少なくとも3時間室温で細胞をインキュベートする。35Sキュウリモザイクウイルスサプレッサー2b、推定エフェクターまたは空のベクターを含むアグロバクテリウム培養物と35S緑色蛍光タンパク質を含むアグロバクテリウム培養物の等量を混合する。1ミリリットルの無針注射器を使用して、ニコティアナベタミアナ16c葉の腹軸側に混合アグロバクテリウム懸濁液を慎重かつゆっくりと浸透させる。
軟部組織拭き取りで葉から残りの細菌懸濁液を取り除き、浸潤したパッチのマージンをマーカーペンで丸で囲みます。浸潤後3~4日、長波紫外灯を用い、浸潤した葉の斑点中のGFP蛍光を視覚的に検出する。浸潤後2週間、ランプを使用して、全身RNAサイレンシングのために植物全体の新しく成長した葉を検出します。
浸潤後4~7日で葉組織からRNA全体を分離するには、浸潤したニコチアナ・ベタミアナ16cパッチから葉組織をモルタルに集める。乳鉢に液体窒素を入れ、粉砕ロッドで細かい粉末に組織を粉砕し、粉末を無菌2ミリリットルチューブに移します。すぐに100ミリグラムの組織の体積でRNA分離試薬をフード内のサンプルチューブに加え、均質化するために激しく渦を巻き、室温で5分間インキュベートします。
ボンネット内の各チューブに、RNA分離試薬1ミリリットル当たり200マイクロリットルの体積にクロロホルムを加え、15秒間激しく振り、室温で5分間インキュベートします。ホモゲネートを摂氏4度で15分間12,000倍に遠心する。上清を新しいRNaseフリーチューブに移し、ペレットを捨てます。
上清に0.7容量のイソプロパノールを加え、数回穏やかに反転し、室温で10分間インキュベートします。12,000グラムで摂氏4度で15分間遠心分離することによりRNAペレットを沈殿させる。上清を捨てます。
70%エタノールでペレットを洗浄し、フード内のペレットを空気乾燥させます。65°Cの水浴で10〜20分間インキュベートすることにより、ジエチル・ピロカーボネート処理水にRNAを溶解します。GFPメッセンジャーRNAレベルのノーザンブロット分析を行うために、1.2%ホルムアルデヒド変性アガロースゲルを1X MOPSランニングバッファに調製します。
RNAをRNA負荷色素と1対1で混合し、摂氏65度で10分間インキュベーションしてRNAを変性させます。変性したサンプルを氷の上ですぐに1分間冷やします。ピペットを使用して、RNAが十分に分離されるまで50分間、ゲルとエレクトロフォレスのウェルにサンプルを50分間ロードします。
ゲルを20倍の生理食塩水ナトリウムクエン酸バッファーにリンスし、ホルムアルデヒドを除去します。20X生理塩水ナトリウムクエン酸バッファー、ペーパータオル1層、ウェットWhatman紙の2層、ゲルの1層、ナイロン膜の1層、湿ったWhatman紙の2層、乾燥したWhatman紙の2層、ガラス板、および重量を設定することにより、一晩毛細血管移動を行います。朝、ゲル中のRNAはナイロン膜に移されます。
膜をクエン酸2X生理塩水ナトリウムに浸し、濡れた膜をUV架橋にさらしてRNAを膜に固定します。原稿に従って進みます。3〜4週齢のニコチアナベタミアナ16c植物の完全に発達した葉は、35S GFPを運ぶアグロバクテリウム混合物とのパッチに共浸透した。
浸潤後4日間で、浸潤領域のGFP蛍光を自然光と長波UV光下で画像化した。ノーザンブロットは、35S GFPプラスEVを発現する葉よりも35S GFPプラス35S CMV2bまたは35S GFPプラス35S PSR1を発現する葉にGFPメッセンジャーRNAがより高く蓄積したことを明らかにした。アグロインフィルトレーションアッセイは、2週齢のニコチアナベタミアナ16c苗の葉のサイレンシング信号の広がりを評価するために行った。浸潤後14日で、EVの98%以上が全身葉に明らかなGFPシグナル伝達を示さなかった。
一方、CMV2bおよびPSR1の両方がサイレンシング信号の全身的な広がりを効率的に阻害した。GFP蛍光は、共浸潤植物の約80%で観察され、残りの20%では、新たに出現した葉にわずかな赤い静脈が現れた。この技術は、研究者が多くの植物病原体によって分泌される新しいRNAサイレンシングサプレッサーを同定する道を開きます。
植物と適切なODの組み合わせは、この手順を試みるときに覚えておくべきことが最も重要です。この手順に従って、RNAサイレンシングサプレッサーの機能的特徴付けにより、これらのサプレッサが宿主RNAサイレンシングを押す仕組みと、その出力が何であるかが調べられます。植物に潜入する際は安全ゴーグルを着用し、実験の全工程でラテックス手袋を着用してください。
