NASHは、世界で最も重要な慢性肝疾患の1つです。それは線維症、肝硬変、そして最終的には肝臓癌に進行する可能性があります。NASHにおけるECMの動的変化を研究することは、線維症をよりよく理解するのを助けることができる。
従来のイメージングでは、3D ECM構造の変化を実証できず、肝線維症における動的ECMリモデリングプロセスの理解が制限されています。開始するには、手順の前にマウスの重量を量ります。マウスを麻酔した後、バリカンを用いて腹側を剃り、70%エタノールで皮膚を消毒する。
マウスを背中に置き、脚をテープで手術用ボードに固定します。メイヨーハサミとアドソン鉗子を使用して、下腹部を横方向に3センチ切開します。そして、胸腔を開かずに下腹部から剣状突起まで垂直に5センチメートルの切開を行います。
腹膜を開いた後、腸を動物の左側にそっと置き、レーヨン先端のアプリケーターで肝臓の右葉を持ち上げて門脈を露出させます。門脈をカテーテル挿入するには、24ゲージのIVカテーテルを門脈の遠位端に誘導します。門脈が肝葉に分岐する前にカテーテルの先端を配置します。
カテーテルが静脈に入ったらすぐに針を抜いてください。カテーテルを介して1ミリリットルの注射器を使用して肝臓をPBSに灌流することにより、カテーテルが静脈内に正しく配置されていることを確認します。デュモンマイクロ鉗子、カストロビエホマイクロニードル、および4-0縫合糸を使用して、門脈の分岐の下にステッチを配置し、1センチメートル下に2番目のステッチを配置してカテーテルを固定します。
長さ1メートル、内径3ミリ、外径4.1ミリのシリコンチューブにルアーコネクターでカテーテルを接続します。シリコンチューブを蠕動ポンプと脱イオン水を含むリザーバーに接続します。チューブ内の気泡を慎重に取り除き、灌流中に新しい気泡が発生しないようにしてください。
蠕動ポンプの流量を毎分0.2ミリリットルに設定します。最初に脱イオン水で2時間熟読すると、灌流中に肝臓の色が赤から黄色に変わります。灌流溶液を0.5%デオキシコール酸ナトリウムに切り替えて一晩続けると、灌流の終わりに肝臓が白くなります。
灌流溶液を脱イオン水に切り替え、2時間灌流します。デュモンマイクロ鉗子とマイクロスプリングハサミを使用して脱細胞化された肝臓を収集し、PBSを含むペトリ皿で注意深く洗います。脱細胞化肝臓の小片を顕微鏡スライドに移し、組織を中央に置きます。
組織の乾燥を防ぐために、ピペットで10マイクロリットルの退色防止封入剤を組織に追加します。組織をカバーガラスで覆い、小さな力を加えてサンプルを平らにします。カバーガラスの端を無色透明のマニキュアでシールします。
カバーガラスの上部に液浸油を一滴置き、スライドを顕微鏡スライドホルダーに置きます。20倍のオイル対物レンズを液浸オイルに接触するまで下げます。波長405ナノメートルの紫色チャンネルに切り替えます。
シャッターをオンにして、サンプルにピントを合わせます。イメージングの対象地域をナビゲートして配置します。レーザー光による画像取得に移行する前に、シャッターを切ってください。
2光子レーザーを開始するには、コンピューター制御に切り替えて、最初に2光子レーザーをオンにします。次に、2つの光子レーザーコントローラーとシャッターをオンにして、出力電力が2.5ワットを超えていることを確認します。レーザー出力を下げて、蛍光消光を防ぎます。
光電子増倍管とハイブリッドの両方の検出器を選択して調整し、選択した蛍光色素に対応します。同時または順次画像取得を選択します。ピンホールを最高値に調整します。
レーザー波長、ゲイン、パワーの調整、ピクセル滞留時間のオフセット、ピクセルサイズの平均化、ズームを行います。コンピューターの Z コントローラーをスクロールし、Z 寸法を設定します。開始点と終了点を定義し、ボリューム内で指定するイメージの数を選択します。
画像を取得します。2つの光子顕微鏡観察を行った後、脱細胞化を伴わないコラーゲン線維は、コラーゲンネットワークの低解像度画像を明らかにした。脱細胞化細胞外マトリックスでは、固形飼料とファーストフード食の肝臓の形態と空間分布に明らかな違いが観察されました。
コラーゲン繊維と飼料のマウスは、織り交ぜられたよく組織化されたネットワークを示しましたが、ファーストフードのマウスは、接続性の低いコラーゲン束を示しました。肝臓細胞外マトリックスの三次元構造は、固形飼料のマウスのコラーゲン繊維がよく組織化されたネットワークを示したが、ファーストフードの飼料マウスでは示されなかったことを示している。脱細胞化細胞外マトリックス中の原線維性コラーゲンの品質を確認するために、スライドをヘマトキシリンエオシンおよびピクロシリウスレッドで染色した。
ヘマトキシリンとエオシンは、すべての細胞が除去されたことを示しています。Picrosirius赤色染色画像では、飼料給餌マウスからの細胞外マトリックスは、よく組織化されたネットワークを明らかにしました。対照的に、ファーストフード食のマウスは、より密度の高いコラーゲン繊維を示しました。
灌流の前に、チューブ内の気泡を慎重に取り除きます。泡は肝臓の血管を塞ぎ、灌流に影響を与えます。
