この方法は、脂肪および肝組織における脂肪肝炎における肥満誘発性炎症への免疫細胞の寄与に関する免疫代謝分野の質問に答える助けとなる。これらの技術は、非特異的な病原体を含まないげっ歯類ハウジングを通じて達成された非アルコール性脂肪性肝炎の食事誘発モデルにおける脂肪および肝性免疫細胞の単離のために最適化されている。これらの方法は、代謝性恒常性の維持に関与する免疫学的メカニズムの理解を深めるのに役立ちます。
一般的に、この技術に新しい個人は、機能的に生存可能な解離細胞の収率を最大化し、フローサイトメトリーで適切な格子を設定することに苦労します。脂肪組織単細胞懸濁液を生成するには、安楽死させたマウスの胸部に70%エタノールをスプレーし、胸膜ケージの全長に沿って内面および腹壁を通して5〜6センチメートルの中央切開を慎重に行い、胸膜腔および心臓を露出させる。26ゲージの針を使用して、0.9%生理食塩水の少なくとも10ミリリットルを左心室の頂点に注入し、はさみを使用して腹腔を開きます。
次いで、エピゴナダル脂肪組織を解剖し、それを秤量する。脂肪組織を摂氏4度のペトリ皿の中の細かい部分に機械的に解化してから、組織断片を50ミリリットルの円錐形チューブに移す。PBSで0.5%のウシ血清アルブミン(BSA)の1ミリリットルでペトリ皿をリンスし、脂肪組織の1グラム当たり3ミリリットルの新しく調製した脂肪組織消化液をチューブに加えます。
摂氏37度で20分、毎分200回転した後、PBSに0.5%BSAの5ミリリットルを加え、脂肪消化を氷の上に置きます。溶液を10ミリリットルの血清ピペットで複数回トリチュレートし、プランジャーを使用して100マイクロメートルのストレーナーを通して溶液を通過させます。遠心分離によって組織分数を分離し、ピペットを使用して浮遊アディポサイト画分を廃棄する。
1ミリリットルのアンモニウム-塩化カリウム、またはACK、リシスバッファー中の間質血管分画細胞ペレットを再懸濁し、数秒後にPBSで2%胎児子牛血清、またはFCSの10ミリリットルでの溶血反応を停止する。次いで、遠心分離により単離された白血球を採取し、250マイクロリットルの2%FCSをPBSでカウントするためにペレットを再懸濁する。シリンジスタンプを使用してペトリ皿の組織を摂氏4度で機械的に解震する前に、肝臓を氷の上のPBSの円錐形のチューブに収穫します。
解剖した肝臓組織断片を10ミリリットルの温かい肝臓消化液を含む50ミリリットルのチューブに移し、ペトリ皿を3ミリリットルの新鮮な肝臓消化溶液で洗いすす。摂氏37度で20分、毎分200回転後、20ミリリットルのHBSSで消化を止め、10ミリリットルの血清ピペットで組織スラリーを複数回トリチュレートします。プランジャーを使用して、100マイクロメートルのストレーナーを通して組織溶液を通過させ、遠心分離によって肝細胞を採取する。
ペレットを20ミリリットルの新鮮なHBSSで再懸濁し、遠心分離により肝細胞マトリックスを除去する。遠心分離のための上清を収集し、HBSSで33%低粘度密度の勾配媒体溶液の10ミリリットルでペレットを再懸濁する。肝臓免疫細胞を密度勾配遠心分離により分離し、白血球ペレットをACKリシスバッファーの1ミリリットルで再懸濁する。
室温で4分後、HBSSの10ミリリットルでライシスを停止し、遠心分離のために15ミリリットルのチューブに30マイクロメートルの細孔ストレーナーを介して細胞をフィルタリングします。次いで、2%FCSの250マイクロリットルのペレットを、数えてPBSで再懸濁する。単離された白血球集団のフローサイトメトリック解析では、目的の組織から個々のポリスチレン蛍光活性化細胞選別、またはFACSチューブにPBSの100マイクロリットルの100マイクロリットルの6細胞に最大3倍の10を加える。
各チューブに10マイクロリットルの抗CD16/CD32抗体を加えて氷上で10分間非特異的結合を遮断し、その後、適切な量の抗体混合物と1マイクロリットルの生存細胞識別を可能にするサンプル当たりの生存性染料を1マイクロリットルで染色します。光から保護された摂氏4度で20分後、1回の洗浄につき2%FCSとPBSの2ミリリットルでサンプルを2回洗浄し、遠心分離機を300倍gで摂氏4度で5分間洗浄します。次に、新鮮なPBSプラスFCSでペレットを再懸濁する。
フローサイトメトリーで細胞を解析するには、未染色の陰性対照サンプルを使用して前方散乱と側面散乱を設定し、フローサイトメーターの電圧を調整して、生じ得る白血球集団を検出し、破片を除外します。次に、実験サンプルを実行する前に、多色補償のための単一の染色対照サンプルを実行し、チューブ当たり4つのイベントに少なくとも5回10を収集する。次に、分析のためにFCSデータファイルをエクスポートし、CD45陽性白血球の格子戦略を設定して、その後の対象の免疫細胞集団の同定を可能にする。
ここで、ラット性分性およびマウスペリゴナリ脂肪における生存性染色を含むT細胞亜集団に対する代表的なゲーティング戦略が示されている。CD45陽性白血球は、最初にCD4およびCD8用にゲートされ、その後CD44およびCD62リガンドがナイーブ、中央記憶、エフェクター記憶およびエフェクターT細胞を区別する。CD44陽性細胞は、さらにCD127、キラー細胞レクチン様受容体G1、およびプログラム死-1で特徴付けられる。
ここで、B細胞、顆粒球、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、樹状細胞を分析するための格言戦略が示されている。非SPF条件で収容される高脂肪食マウスではエフェクターメモリCD4陽性およびCD8陽性細胞の割合が高いのに対し、肝内ナイーブCD4陽性およびCD8陽性T細胞は、第7週のSPF高脂肪食マウスと比較して、これらの動物ではかなり低いことが判明した。重篤な脂肪滴の増加を含む、大行胞性脂肪症、小葉炎症、肝細胞バルーン、および破壊された小葉構造は、高脂肪食暴露マウスに見られるが、一部のSPFマウスだけが肝臓に軽度の脂肪蓄積を示す。
さらに、ナチュラルキラー細胞の割合は、高脂肪食暴露マウスの末腸脂肪組織において高いが、一方、高脂肪食SPFマウスは樹状細胞のより高い割合を示した。この手順を試みる場合、特に明記されていない限り、細胞を氷の上や暗い状態に保つことが重要です。単細胞懸濁液を適切に調製する方法と、フローサイトメトリー実験のためにマウス脂肪と肝組織を分離する方法をよく理解する必要があります。
