ELISA技術は、蚊の媒介生物のマラリア原虫を高い感度と特異性で検出するのに非常に役立ち、同時に多くのサンプルを処理することができます。この技術により、研究者はサンプル処理の準備が整うまで蚊のサンプルを保持でき、種特異的なモノクローナル抗体を使用してマラリア原虫種を区別するために実行できます。蚊の頭と胸部を腹部から分離してサンプルを調製し、事前にラベル付けされた1.5ミリリットルの遠心分離機用粉砕チューブに入れます。
各チューブに50マイクロリットルの粉砕バッファーを加え、乳棒でサンプルを均質化します。乳棒を250マイクロリットルの粉砕緩衝液ですすぎ、溶液をチューブに加えて最終容量を最大300マイクロリットルにします。サーカムスポロゾイトタンパク質のELISAプレートを調製し、スポロゾイトELISAワークシートに記入します。
抗体溶液をPBSで調製し、プレートあたり5ミリリットルの溶液を追加します。50マイクロリットルの抗体溶液をELISAプレートの各ウェルにピペットで移します。プレートに蓋をして、室温で30分間または一晩インキュベートします。
ウェル内の溶液を吸引し、プレートをペーパータオルで5回叩いて液体を取り除きます。ウェルプレートに200マイクロリットルのブロッキングバッファーを追加し、蓋をします。室温で1時間インキュベートし、ウェル内容物を吸引します。
再度、プレートをペーパータオルで軽くたたいて液体を取り除きます。50マイクロリットルのポジティブコントロールをH oneとH 2のウェルに加えます。次に、50マイクロリットルのブロッキングバッファーを、GからGの行Cの列1と2のウェルに加え、ポジティブコントロールの50マイクロリットルをG1とG 2のウェルに加えます。
ポジティブコントロールをG 1とG 2から開始し、次にF 1とF 2をC 1とC 2まで連続希釈します。50マイクロリットルのネガティブコントロールをウェルA 1、A 2、B 1、およびB 2に加えます。50マイクロリットルのホモジネート溶液を抽出し、未知のウェルに加えます。
プレートを覆い、室温で2時間インキュベートします。基材AとBを1対1の比率で混合することにより、基質溶液を調製します。各プレートに5ミリリットルのワーキングコンジュゲート抗体溶液を添加して、必要な容量を決定します。
1.5ミリリットルのチューブ内の100マイクロリットルの基質溶液に5マイクロリットルのペルオキシダーゼ標識抗体溶液を添加することにより、ペルオキシダーゼ活性を評価します。ウェル内容物を吸引し、プレートを逆さまにしてペーパータオルの上に置いて液体を取り除きます。200マイクロリットルのPBS Tweenでウェルを2回洗います。
ウェル内容物を吸引し、プレートを5回叩きます。各ウェルに50マイクロリットルのペルオキシダーゼ標識抗体溶液を加えます。その後、室温で1時間暗闇でインキュベートします。
ウェル内容物を吸引し、ペーパータオルでプレートを5回たたきます。200マイクロリットルのPBS Tweenでウェルを3回洗浄し、内容物を吸引し、プレートを5回軽くたたきます。各ウェルに100マイクロリットルの基質溶液を加えます。
プレートを覆い、室温で30分間暗所でインキュベートします。インキュベーション後、ELISAプレートリーダーを使用して405〜414ナノメートルの吸光度を読み取ります。カットオフ値を超える値を持つ吸光度を持つサンプルに正の値をラベル付けし、標準試料を使用してサンプル中のCSP濃度を決定します。
吸光度の値と溶液濃度をプロットして、標準曲線を生成します。線形回帰法を使用して最適な適合を決定します。正のサンプルの各吸光度値の方程式を解いて、CSP濃度を決定します。
ABTSでELISAを30分間行った後、ウェル内にかすかな緑色が現れることでスポロゾイト感染が検出されました。ポジティブコントロールでは、ウェル内の色の変化は見られませんでした。ネガティブウェルとポジティブウェルの吸光度値を決定しました。
ポジティブウェルはカットオフ閾値を超える吸光度値を示し、ネガティブコントロールは有意に低い値を示しました。さらに、他の80の未知のウェルの吸光度値も得られた。実線はネガティブコントロールウェルの平均吸光度を表し、破線はポジティブの閾値を表します。
標準曲線を使用して、井戸A 7のCSP濃度は、非特異的ベクターを防ぐために、ELISA処理のこのステップを迅速に実行する必要があるマイクロリットルあたり0.35ピコグラムであると決定されました。さらに、すべてのサンプルと溶液は、微生物の増殖を防ぐために冷蔵庫に保管する必要があります。研究者は、PCRなどの他の方法で陽性検出を確認することをお勧めします。
これにより、特に唯一の読み取り値がしきい値を超えて評価されている場合に、信頼性が大幅に向上します。この技術により、研究者は蚊の感染の可能性についてより大規模な調査を行うことができ、これは主要な媒介者を特定するために重要です。
