アノフェレスガンビー蚊からの幼虫唾液腺の解剖と免疫染色

昆虫の唾液腺には、多くのヒト疾患を伝える上で必要とされている。だから、給与腺生物学のより良い理解は、病気予防のための既存の戦略に追加し、私たちを助ける必要があります。この技術は、候補レギュレータの突然変異が、マラリア原虫の感染に影響を与え、マラリアの感染に影響を与える可能性があるかどうかを迅速に尋ねることができます。

あなたが蚊の幼虫と一緒に働く最初の数回は、彼らがすぐに動くように把握するのが難しいです。練習すればするほど、良い結果が得られる。手順を開始すると、私の研究室の学部研究アシスタントであるマリソル・ルチェッティです。

実験を開始するには、解剖顕微鏡のステージにトイレプレートを置き、10個の蚊L4幼虫をトイレプレートに移します。次に、幼虫とは別のトイレプレートに解剖液の滴を置きます。鉗子を使用して、25%エタノールの解剖液ドロップに1つのL4幼虫を配置します。

各手に5本の鉗子を持ち、頭のすぐ下の鉗子で幼虫をつかみ、支配的な手で幼虫の頭をつかみ、頭を最小限の力でそっと引っ張り、体の残りの部分から切り離し、腺は頭に取り付けられたままです。幼虫の死体の体部分を捨て、頭または唾液腺を1ミリリットルのPBSに集め、1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブで、唾液腺が緩衝液の底に沈むのを待つ。翌日、溶液を排出して組織を固定し、1ミリリットルの冷たい100%アセトンを90秒間分ける。

アセトンを取り除いた後、PBSの1ミリリットルで、組織を3回やさしくすすます。免疫染色の場合、RAB 11のような一次抗体を添加し、適切な希釈で、PBSの総容積の200マイクロリットルに入れる。ピペットチップでチューブの内容物をそっと旋回します。

一次抗体を一晩4度でインキュベートし、続いてPBSを1ミリリットルで3回洗浄する。次に、二次抗体であるAlexa Fluor 488ヤギ抗ウサギを適切な希釈液に200マイクロリットルの総体積で添加します。内容物をピペットチップと混合した後、ナイルレッド、Hoechstなどの染料で組織を200マイクロリットルのPBSにインキュベートし、室温で60分間、続いてPBSで3回洗浄します。

顕微鏡スライドを準備し、ピペットで200マイクロリットルのグリセロールを加え、柔らかいブラシを使用して顕微鏡スライドごとに、腺と内部構造を取り付けた20までの染色ヘッドを移します。ヘッドサンプルを広げ、グラススライドに沿って均等に配布します。解剖顕微鏡で見て、2組の鉗子を使用して、2つの組織を慎重に反対方向に引っ張ることによって、幼虫の頭部を腺から分離する。

すべてのサンプルが完了したら、1.5ミリメートルの厚さのカバースリップをスライドの上にそっと置き、気泡の形成を避け、滑らかなマニキュアでスライドを密封します。唾液腺は、ステージ4の幼虫から比較的簡単に解剖できる。オスとメスの幼虫は、女性の胸郭に沿って、赤いストライプによって後期L4幼虫段階で区別することができます。

触角形態はまた、男性では、見ることができるように女性のL4幼虫よりも精巧で、白い矢印が指摘され、女性のアンテナが左側の画像に、男性のアンテナが右側にあります。初期のL4段階の幼虫から分離された唾液腺は、Hoechstで染色され、狭い収縮によって分離された近位および遠位葉を明らかにする。形成管腔を調べ、免疫染色遠位唾液腺において、中~後期L4幼虫を調べた。

分泌細胞の有端領域は、形成された内腔を取り囲んで、濃いナイル赤染色を有し、微細絨毛のような構造を示唆した。ラブ11染色は、近く、尖体表面に観察された。時間と一歩しかなく、それは冷たいアセトンの組織の90秒のインキュベーションです。

このプロトコルは最近開発されたばかりですが、蚊の唾液腺に取り組んでいる人には役に立つと期待しています。私たちは完全に頻繁にそれを使用することを期待しています。