私たちは、博士に感謝。タンザニアから蚊の標本を提供するためのグラスゴー大学のUCデービス博士カタリーナKreppelでアンソニー·コーネルとローラ·ノリス。私たちは、ザンビアから蚊のサンプルを共有するための公衆衛生のジョンズホプキンススクールさんスミタ·ダス博士ダグラスノリスに感謝。我々はまた、アッセイデザインのトレーニングのために獣医遺伝学研究所の李氏V.ミロンに感謝。この作品はR01AI 078183とR21AI062929を付与国立衛生研究所によってサポートされていました。

1. PCR増幅<ol><li> 1.5ミリリットルのマイクロチューブに（補足表S1を参照してください）​​すべてのPCRプライマーを混ぜる。各SNPは、2つのプライマー（順方向および逆方向）を有している。各PCRプライマーのストック濃度を100μmに保たれていることを確認します。 （補足表S2を参照してください）​​ベンチでのピペッティング誤差と時間を削減するために500〜1,000の反応のための十分なプライマーミックスを作成します。必要に応じて、-20℃でチューブや店舗あたり100〜200の反応のためのアリコートを準備します。 </li><li>製造業者のプロトコル（表1）で説明したようにPCRカクテルを準備します。 96の反応のためのボリュームは、20パーセントのオーバーハングが含まれています。渦2000×gで30秒間のPCRカクテル軽く遠心を含むチューブ。 </li><li>非スカート96ウェルプレートの各ウェルにPCRカクテルの3μLを分注する。リピーターピペットは、このプロセスのための時間を節約することができる。 </li><li>各ウェルに蚊の適切なゲノムDNAの2を添加する。 注記：メートルからゲノムDNAを得る工程<html> osquito組織（頭部/胸部、腹部または全身）は、他の文献29-32に記載されている。感染蚊（頭部/胸部におけるマラリア原虫 ）から血液（腹部）でマラリア原虫を持つものを区別するための適切なDNA抽出プロトコルを選択します。私たちは、一般的に蚊のボディパーツ（頭部/胸部または腹部）から抽出したDNAを使用するため、DNA濃度は0.05-2ng /μLごとに異なります。トータルDNA入力が製造者の推奨（5-10ng / rxnの）未満であるが、ここでは一般的に堅固なSNPは、全ゲノム増幅なしでDNAサンプルの98％か​​ら呼び出し得る。 </li><li>プレートをシール、穏やかに混合またはボルテックスし、370×gで1分間遠心する。 </li><li> PCR増幅を行うために、以下のサーモサイクラープロトコルを使用して：（1）94℃で2分間、（2）94℃30秒間、（3）56℃で30秒間、（4）72℃で1分間（5）繰り返し工程（2） - （4）45サイクルについて、（6）1分、4℃保持72℃。 </li></ol>_title &quot;&gt; 2。SAPトリートメント<ol><li> 96ウェルプレート中のSAP酵素溶液を調製した（表2参照）。プレート内の96サンプルを処理する。 96の反応のためのボリュームは、20パーセントのオーバーハングが含まれています。 </li><li>ボルテックス軽くSAP酵素溶液のチューブと2000 X gで30秒間遠心する。各ウェルに、SAP酵素溶液2μlを分注する。ここでも、リピーターピペットは、このプロセスのための時間を節約することができます。 </li><li>プレートをシール、穏やかに混合またはボルテックスし、370×gで1分間遠心する。 （1）37℃で40分間酵素を失活させ、5分間（2）85℃、（3）4℃の保持：次のようにプレートをインキュベートする。このステップが完了すると、続行する前に-20℃でプレートを保存する。 2週間内に格納されているプレートを処理します。 </li></ol> 3. SNP拡張<ol><li>サンプルプレートは、SAP処理後に凍結している場合、それは続行する前に室温に解凍することを可能にする。 </li><li>エクステンションプライマーミックス（補足表S2）を準備します。各SNPは1エクステを持ってnsionプライマー。 500μMの各伸長プライマーのストック濃度にしてください。必要に応じて、-20℃でチューブや店舗あたり100〜200の反応のためのアリコート。 </li><li> 96反応容量が20％のオーバーハングを含み、表3に記載されているように拡張ミックスを調製する。 </li><li>ボルテックス軽く延長カクテルのチューブと2000×gで30秒間遠心する。各ウェルに延長カクテル2μLを分注する。ここでも、リピーターピペットは、このプロセスのための時間を節約することができます。 </li><li>プレートをシール、穏やかに混合またはボルテックスし、370×gで1分間遠心する。 図1に示すように、プレート熱サイクル。この時点で、質量分析に進むか、または2週間Cまで-20℃でプレートを格納する。 </li></ol>質量分析を最適化するため4.エアコンSNP拡張製品<ol><li>サンプルプレートは、SNPの拡張後に冷凍される場合は、続行する前に室温に解凍することを可能にする。 </li><li>そのコンタから樹脂の15mgのを転送細長いスプーンを使用したディンプルプレートにINER。ディンプルプレートのウェル内に樹脂を広めるためにスクレーパーを使用してください。樹脂を広めるためにディンプルプレート間で左右にスクレーパーをスイープ。樹脂は、各ウェルに存在していることを確認します。 </li><li>スクレーパーを使用してディンプルプレートから余分な樹脂をこすり。樹脂は、少なくとも20分間、ディンプル板に放置。樹脂せながらディンプル板に立って、サンプルプレートの各ウェルにHPLC等級の水41μlを添加する。 </li><li>静かにディンプルプレートに、サンプルプレート逆さまに置きます。ディンプルプレートのウェルを有するサンプルプレートのウェルを整列ディンプルプレートの小さな丸みを帯びた後、に対してサンプルプレートのリセットを確認してください。 </li><li>樹脂は、サンプルプレートのウェルにディンプル板から外れるようにして裏返して優しく、一緒にサンプルプレートとディンプル板を保持する。樹脂がサンプルプレートに出て落ちるようにディンプルプレートをタップします。ディ内のすべての樹脂を確認してくださいmpleプレートは試料プレートのウェルに抜け落ちる。 30秒間3200×gでプレートを遠心。 </li><li> RTで5分間回転器上のサンプルプレートを回転させます。回転子は、サンプルプレートの長軸約360°回転しなければならない。 </li><li> 5分間3200×gでサンプルプレートを遠心します。このステップの後、次のステップに進む前に、最大2週間まで-20℃でのサンプルプレートを保存する。 </li></ol> 5. MALDI-TOF質量分析<ol><li>製造業者の指示に従ってなどSpectroCHIPとしてバイオアレイ上にエアコンのSNP伸長産物を転送します。我々は、このステップのためMASSARRAYナノディスペンサーを使用しています。 </li><li>転送が完了した後、アッセイプレートをアッセイデータベースに設定される方法を定義する。各プレートは、特定のアッセイデザイン（補足表S3）にリンクする一意の識別子を有するように、アッセイプレートに名前を付けます。 </li><li>アッセイプレートを定義した後、質量分析計を用いてスペクトルを取得する。 </li></ol><ol><li>そのようなタイパーアナライザやTyperViewer（シーケノム）などのリアルタイムPCR解析データ解釈ソフトウェアを使用してデータ分析を実行。サンプルレイアウトを含む.xml形式のデータを、各ウェルについての質量スペクトログラム、名を含むマーカー情報、対応するSNPの各バリアント、およびそれぞれの反応に関連するすべてのエラーや警告のメッセージのマスを取得します。得られる質量スペクトル写真については、図2を参照してください。 </li><li>検出閾値（対雑音比の大きさまたは信号）と、各遺伝子型に対して許可耐性/分散を設定することにより、SNP遺伝子型クラスタリング解析を行う。 図3は、04707-KDR位例2 SNP遺伝子型クラスターを示す。 </li><li>表計算プログラムに生じたSNPの遺伝子型コールをエクスポートします。 </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

飛行時間（MALDI-TOF）質量分析法33-37 - PCR増幅、エビアルカリホスファターゼ（SAP）反応、SNP拡張、伸長産物の調節、およびマトリックス支援レーザー脱離/イオン化：MDAは、5つの主要なステップから構成されている。最初のPCR増幅工程は、十分な鋳型DNAがSNP伸長工程で使用できるように各SNPに隣接するDNAを増幅する。 SAPの反応は以下のSNP伸長工程を妨害する可能性が使用されていない...

ハマダラカarabiensis、ハマダラカcoluzziiとハマダラカは、アフリカ1におけるマラリア伝送に関与する主要なベクトルです。これら3種は2形態学的に区別できないとだけ分子アッセイ3-9で区別することができます。また、日常的疫学的および集団遺伝学研究を支援するために行われ、多くの下流のアッセイが存在する。これらには、（1）分化アイランド10-12のための遺伝子型決定アッセイを、 パラ遺伝子のアミノ酸コドン位置番目 1014で非同義SNPを認識する（2）遺伝子型決定アッセイ（ ノックダウン抵抗 、又はkdrの 、SNP）13を含む-18、（3）寄生虫の検出PCR 19-23、及び（4）蚊の中腸24,25にホスト固有のDNAをスクリーニングする。 私たちは、の目標を持つ単一の多重反応にすべてのこれらのアッセイを組み合わせたマルチ検出アッセイ（MDA）を開発アフリカのマラリアベクトルの疫学的に重要な特性をalyzing。 MDAアッセイは、（1）種を検出するための複数のマーカー（A.のarabiensis、A.のハマダラカ、A.のcoluzzii、または3つの他の（なし））kdrの SNPの中で示される、（2）殺虫剤抵抗性（L1014F とL1014S両方）を含む二つの主要なマラリア原虫の、（3）存在下、熱帯熱マラリア原虫およびP.三日熱マラリア原虫 、一鳥類六哺乳類宿主から（4）血液源。 伝統的に、これらのアッセイは、別個のポリメラーゼ連鎖反応を行った。すべてのこれらのアッセイは、従来のPCRプラットフォームを使用して行われている場合には、8-10 PCR反応アッセイを実施し、ゲル電気泳動工程を伴う必要があります。ここで紹介するMDA法は全体で約5時間かかりますしながら、文書化の結果への準備から、個々のPCR反応は、4-5時間かかります。これだけで人件費の90％の節約と等価である。 MDAはここで紹介する5ドルの費用すべての33のSNPの遺伝子型を決定するためにサンプルあたり。これはサンプルあたり約1.50ドルのコスト、これシングルアガロースゲルベースアッセイよりもかなり安価である。 MDAがカバーするすべての特性を検出するアッセイは、サンプルあたり$ 12〜15の費用で8-10別々のアガロースゲルに基づくアッセイの最小値を必要とするであろう。また、MDAは大幅に各寄生虫またはホストソースを検出するための少なくとも3つのマーカーを利用することにより、偽陽性または陰性のを発生させる可能性を低減します。 我々が利用プラットフォームはマラリアベクトルに限定されるものではなく、医学、獣医学、および基本的な生物学26-28など、多種多様な用途で使用することができる。深い関連研究または集団遺伝学サンプル（数百程度）を多数同時に複数のマーカーのための費用対効果のアッセイスクリーニングが必要含む研究。 2つ以上の別々のPCRアッセイを利用するほとんどの研究は、低コストで迅速な結果を得るために、MDAを実装することができます。 </p&gt;

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="588">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:87px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MassARRAY Analyzer Compact</td>
			<td style="width:87px;">Sequenom</td>
			<td style="width:119px;">MT9</td>
			<td>MALDI-TOF mass spectrometry for genomic applications to analyze nucleic acids.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MassARRAY Nanodispenser</td>
			<td style="width:87px;">Sequenom</td>
			<td style="width:119px;">RS1000</td>
			<td>Transfers completed iPLEX reaction products to the SpectroCHIP</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">iPLEX Gold Genotyping Reagent Set</td>
			<td style="width:87px;">Sequenom</td>
			<td style="width:119px;">10158</td>
			<td>Reagents used for iPLEX assay including SAP kit.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multi-detection assay for malaria transmitting mosquitoes

ハマダラカ種複合体は、アフリカの蚊を送信する主要なマラリアが含まれています。これらの種は、そのような医学的に重要であるので、いくつかの特徴は、典型的には、疫学的研究を支援するために、分子アッセイを使用して特徴づけられる。これらの特性は、種の同定、殺虫剤抵抗、寄生虫感染状況、およびホストの好みが含まれています。 ハマダラカ複合体の集団は、形態学的に区別できないので、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、伝統的に種を識別するために使用される。種が分かると、いくつかの下流のアッセイは、日常的にさらなる特性を解明するために行われる。例えば、パラ遺伝子におけるKDRとしても知られている突然変異は、DDTおよびピレスロイド殺虫剤に対する耐性を付与する。さらに、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）またはマラリア原虫DNAの検出PCRアッセイは、蚊の組織に存在する寄生虫を検出するために使用される。最後に、combinatioPCRおよび制限酵素消化物のnは、ホスト固有のDNAのための蚊吸血をスクリーニングすることによって、ホスト·プ（動物の血液対例えば 、ヒト）を解明するために使用することができる。私たちは、一度に96または384のサンプルについて、単一の多重反応ジェノタイピング33SNPsに上記アッセイの全てを兼ね備えたマルチ検出アッセイ（MDA）を開発した。 MDAは、種、 プラスモディウム検出、およびホスト血液を識別するための複数のマーカーが含まれているので、偽陽性または陰性の発生の可能性が大幅に形質ごとに1つのマーカーを含む、前のアッセイから減少する。この堅牢でシンプルなアッセイは、コスト効率と既存のアッセイの時間の割合は、これらの重要な蚊の特性を検出することができます。

種の同定： サンプルは3種の一つではない場合は、次の5個のSNPは、一緒に、3個のSNP（01073から213、04679から157と10313の3種（A.のarabiensis、AをcoluzziiとA.ハマダラカ ）（ 表4）。識別する-052）を増幅することができない。 殺虫剤抵抗性を推測するためのKDR遺伝子型： パラ電位依存性ナ?...

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A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.

マラリア蚊。送信のためのマルチ検出分析

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

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13.0K ビュー.  School of Veterinary Medicine, University of California - Davis. Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.