これらのプロトコルは、重要な研究ツールおよび潜在的な治療薬である新規HAT阻害剤の効力と選択性を検証するための詳細なステップを提供するため、重要である。このビデオで示されている技術は、実行が容易であり、グローバルおよび地域ヒストンアセチル化に対するHAT阻害剤の影響に関する情報を提供します。遺伝子発現のエピジェネティックな調節を理解することが可能になる。
細部への注意は非常に重要です。プロトコルに段階的に従うことが重要です。原稿の指示に従って0.2ミリリットルPCRチューブ内の10マイクロリットルの体積で酵素反応を準備することから始めます。
その後、完全な反応混合物を摂氏30度で1時間、PCRサーマルサイクラーでインキュベートします。一方、6X SDSサンプルバッファーに対して1~10比で2個のメルカプトエタノールを加えます。PCR サーマルサイクラーからサンプルを取り出し、調製した SDS サンプル バッファーの 2 マイクロリットルを各反応ミックスに追加します。
熱ブロックでサンプルを摂氏95度に5分間加熱し、氷の上で冷却します。サンプルをマイナス20°マイナス80°Cで保存するか、ゲル電気泳動と免疫ブロット法を進めます。1ミリリットルの細胞培養培地中の100,000個のMCF-7細胞を12ウェルプレートの各ウェルに入れ、細胞を80〜90%の合流まで成長させる。
細胞が所望の合流度に達すると、ウェル4、5、および6から細胞培養培地を吸引し、ピペット1ミリリットルの3ミクロモルMS275を培地中に各ウェルに吸引する。次に、ウェル1、2、および3から細胞培養培地を吸引し、各ウェルに希釈したDMSOを1ミリリットルのピペットを用いた。MS275に曝露された細胞中のアセチル化ヒストンの蓄積を可能にするために、4時間培養器に細胞を戻す。
細胞がインキュベートしている間、原稿の指示に従ってDMSOでA-485の希釈を調製する。インキュベーションが終了したら、ウェルから培地を吸引し、希釈液を加える。培養器に細胞を戻し、20時間培養し、ウェルから細胞培養培地を吸引し、PBSの1ミリリットルで細胞を洗浄する。
PBSを吸引し、受動溶菌バッファーの100マイクロリットルを追加します。プレートをマイナス80度で一晩保管してください。DMSOで処理した細胞から超音波処理クロマチンのピペット100マイクロリットルを2つの1.5ミリリットルチューブに、次に各チューブに400マイクロリットルのChIP希釈バッファーをピペットし、総体積を最大500マイクロリットルにします。
チューブの1つから溶液の5マイクロリットルを取り除き、DMSO入力としてマイナス20°Cで保存します。同じようにA-485で処理された細胞から超音波クロマチンで2つのチューブを準備します。ピペットを使用して、IgGおよびH3K27アセチル抗体をDMSOおよびA-485サンプルに添加します。
その後、各チューブに20マイクロリットルのタンパク質A磁気ビーズを加え、ビーズが十分に再懸濁されていることを確認します。サンプルを摂氏4度で一晩回転させます。タンパク質Aのペレットは、磁気セパレータを使用して、ビーズを邪魔することなく上清を除去します。
500マイクロリットルの低塩洗浄バッファーでビーズを1ミリリットルに洗い、摂氏4度で5分間回転させます。クイックスピンダウンを実行し、磁気セパレータでビーズをペレットし、上清を取り除きます。高塩洗浄バッファー、塩化リチウム洗浄バッファー、および TE バッファーで洗浄手順を繰り返します。
TEバッファーで洗浄した後、入力サンプルをフリーザーから取り出し、氷の上に置きます。プロテイナーゼKのアリコートを解凍し、次いで磁気セパレータを用いてビーズをペレットし、ビーズからTEバッファーを除去する。入力サンプルを含むすべてのサンプルに100マイクロリットルのChIP溶出バッファーと1マイクロリットルのプロテイナーゼKを加え、サーモサイクラーを使用して2時間摂氏62度で振度してインキュベートします。
インキュベーション後、サンプルを摂氏95度まで10分間加熱し、室温まで冷却します。磁気セパレータを用いた磁性ビーズをペレットにし、DNA含有上清を新しい1.5ミリリットルチューブに移します。標準 PCR クリーンアップ キットを使用して DNA を精製し、qPCR を実行します。
インビトロヒストンアセチルトランスファーゼアッセイを用いて、ヒストン基質に対するp300 HAT活性に対するアナカルド酸の効果を調べた。濃度範囲を試験し、アセチルCoAを陰性対照反応に添加しなかった。イムノブロットの結果をImageJで定量し、DMSO対照と比較して100マイクロモルアナカルディン酸におけるアセチルH3K18およびアセチルH3K9の明確な減少を示した。
クロマチンハイパーアセチル化阻害アッセイにおいて、いくつかのリジン残基にヒストン3のアセチル化を強くアップレギュレートしたHDACi MS275を用いたMCF-7細胞の治療。アセチルH3K18およびアセチルH3K27の基底レベルは低く、ChHAIアッセイにHDACiを添加することの利点を示した。MS275で前処理された細胞にA-485を添加すると、H3K18およびH3K27でヒストンアセチル化が増加したがH3K9は減衰しない。
免疫ブロットの結果も ImageJ で定量化した。ChIP qPCRは、遺伝子遺伝子発現を制御する遺伝子調節要素におけるHAT阻害剤の効果を調べるのに用いられた。DMSOサンプルにおいて、IgG対照抗体によって沈殿したDNAは、シクリンD1プロモーターに対するqPCR反応においてアセチルH3K27抗体よりも高いCt値を産生し、非特異的IgG対照がプロモーターでアセチルH3K27特異的抗体よりも少ないDNAヒストン複合体を沈殿させたことを示している。
DMSO制御と比較して、A-485はサイクリンD1プロモーターでアセチルH3K27濃縮を減少させた。重要なことに、A-485は、細胞培養においてアセチルH3K27を有意に減少することが知られている。このプロトコルを試みるとき、in vitro HAT および ChHAI アッセイの事前インキュベーションステップは不可欠であり、忘れてはならないことを覚えておいてください。
また、入力サンプルを保存し、ChIP中のビーズの損失を避けるために覚えておくことも重要です。これらの手順を実行した後、ChIP-seqは、ゲノム全体の調節要素におけるヒストンアセチル化に関するグローバル情報を得るために実行できる追加の方法です。これらのプロトコルは、科学者が新しいHAT阻害剤を慎重に検証し、文献に低品質の化学プローブを公開することを避けるのに役立ちます。
検証されたHAT阻害剤は、潜在的な治療薬としてさらなる開発を受けることができる。
