このプロトコルは、アルギニンメチル化のレベルおよび動態を定量化することを可能にする。この修飾は重要な調節的役割を果たし、疾患のバイオマーカーとして役立つ可能性がある。この方法の利点は、細胞、培地から組織、生体液に至るまで、ほぼ無制限の数のマトリックスに対してシンプルなワークフローを提供することです。
アルギニンメチル化は多くのヒト癌で上昇しており、アルギニン法トランスフェラーゼの最初の阻害剤は臨床試験でテストされています。この方法は、患者の層別化とリスク評価に役立つ可能性があります。手順を実演するのは、私の研究室の研究技術者であるハンスヨルグ・ハビッシュです。
液体サンプルの場合は、200マイクロリットルのサンプルに400マイクロリットルの氷冷メタノールを加え、摂氏マイナス20度で30分間インキュベートします。このサンプルを10, 000 Gで摂氏4度で30分間遠心分離します。上清を移動し、ペレットを1.5ミリリットルのチューブに集めます。
固体材料の場合は、600〜30ミリグラムの組織または細胞ペレットを含むパルプ化チューブに66%メタノール水を加えます。軟組織を20秒間1回、硬組織を20秒間2回、間に5分間隔で均質化します。直ちにサンプルを氷の上に置き、すべてのライセートを新しい1.5ミリリットルのチューブに移し、続いてインキュベートします。
次に、サンプルを10, 000 Gで30分間遠心分離します。摂氏4度で、1.5ミリリットルのチューブで上清を選択し、この上清を使用してタンパク質加水分解を進めます。各チューブのキャップを切り捨てます。
次に、各サンプルに500マイクロリットルの9モルの塩酸を加えます。最後に、チューブをガラス管に入れます。キャップでしっかりと閉じて、適切な密閉を確保し、これらのチューブを部分的に砂で満たされたガラスビーカーに入れます。
乾燥室で摂氏110度で16時間サンプルを加水分解します。サンプルを冷却し、高真空遠心分離機を使用して一晩凍結乾燥します。翌日、完全に乾燥したペレットを1ミリリットルの0.1モル塩酸に溶かします。
各チューブに50マイクロリットルのクロロホルムを加え、1, 000マイクロリットルのピペットを使用してペレットを完全に溶解します。全容量を新しいチューブに移し、サンプルを10分間遠心分離します。二相性液体の上相を新しいチューブに慎重に集めます。
手動にはプラスチックチューブを使用し、ロボット固相抽出にはガラスチューブを使用してください。手動固相抽出の場合は、すべての実行でカートリッジを事前に調整した後、1分間遠心分離します。その後、サンプルをSPEカートリッジにロードし、室温で600 Gで2分間遠心分離します。
カートリッジを1ミリリットルの水で3回洗浄し、各洗浄に続いて1分間遠心分離します。その後、1ミリリットルの0.1モル塩酸で5回洗浄し、続いて室温で800Gで1分間遠心分離した。カートリッジを1ミリリットルのメタノールで2回洗浄した後、1分間遠心分離します。
アルギニンとその誘導体を1ミリリットルの3つのX置換溶液を加えて15ミリリットルのチューブに溶出し、1分間2回遠心分離します。ロボット固相抽出の場合、溶出液を採取するためのチューブと二相性液体の上相を含むガラスチューブをロボットのそれぞれの位置に配置します。手動 SPE で説明されているステップに基づいて、ソフトウェアでアプリケーションまたはメソッドを使用します。
サンプルを一晩凍結乾燥して完全に乾燥させ、アンモニアと水を取り除きます。各サンプルを500マイクロリットルのNMRバッファーに均一になるまで溶解します。次に、等量の均質なサンプルを各NMRチューブに移します。
SPEプロトコルを用いて精製した酵母タンパク質加水分解物のJ-RESスペクトルをここに示す。異なる特徴的な化学シフトは、L-アルギニンとADMAを3.25および3.02ppmで識別することができます。両方の物質は、細胞マトリックス中で分離および定量することができます。
それぞれの化学シフトにおける特定のメチル基またはメチレン基のプロトン数に基づいて、1つのH核磁気共鳴分光法は正確な定量を可能にする。このアプローチを用いると、SDMAとMMAの1H核磁気共鳴化学シフトを、SDMA2.76ppmとMMA2.74ppmの特徴的な化学シフトによって分離し定量することができます。このプロトコルを実行するときは、水溶性画分を含む二相性液体の上相をピペットで注意深く集め、それを新しいチューブに移します。
手動SPEには1.5ミリリットルのチューブを使用し、ロボットSPEにはクラスガラスを使用してください。クロロホルムとその内容物をこぼさないでください。アルギニンおよびメチル化アルギニン種を含む溶出液は、NMR分光法を用いて分析される。
これにより、これらの種の絶対量が得られます。現在、アルギニンメチル化の病態生理学的役割の解明を目指す多くの基礎研究プロジェクトで使用されています。さらに、タンパク質アルギニンメチル化をいくつかのヒト疾患におけるバイオマーカー候補として評価しています。
