この方法は、ナノ粒子の局所適用を画像顕微鏡腫瘍、特に卵巣癌の転移などの血管系にまだアクセスできない悪性腫瘍において使用する。この技術は、比測定、偽シグナルを減少させ、腫瘍の真の範囲を明らかにするために、単一のスキャンで標的化および非標的ナノ粒子をイメージングする。これらのナノ粒子は、卵巣癌および他の多くの腫瘍タイプの高精度画像化のための腹腔内または静脈内注射によって投与することができる。
金ナノスターコア合成のために、摂氏4度の磁気攪拌板に800ミリリットルの新鮮なアスコルビン酸溶液を含む円錐形フラスコを置き、安定した渦を誘導する。迅速に渦に作りたてのテトラクロロウ酸溶液の8ミリリットルを追加します。数秒以内にナノ星が形成され、溶液は濃い青色を想定します。
ナノスター懸濁液を50ミリリットルの円錐形チューブに注ぎ、スピンの終わりに各チューブから最後の200マイクロリットルの上澄み物を除くすべてを吸引します。マイクロピペットを使用して各チューブ内のナノ粒子を再懸濁してから、すべてのナノ粒子を単一の透析カセットにプールします。その後、ナノ粒子を少なくとも3日間、毎日水を変える2リットルの脱イオン水に対して透析する。
シリカシェル形成の場合、まず10ミリリットルのイソプロパノール、500マイクロリットルのTEOS、200マイクロリットルの脱イオン水、60マイクロリットルの色素を50ミリリットルの円錐形チューブに加えます。そして、エタノールの3ミリリットル、15ミリリットルのチューブに水酸化アンモニウムの200マイクロリットルを追加します。次に、透析したナノスターを超音波処理してクラスターを分散させ、1.2ミリリットルのナノスターをチューブに加えます。
50ミリリットルのチューブをボルテックスミキサーに置き、安定した渦を誘発する。ナノスター溶液を50ミリリットルチューブに急速に加え、さらに5秒ほど混合してから、室温で300 RPMで15分間素早くシェーカーに移します。2つのチューブは、ナノスター上でシリケイ作用が起こることを確実にし、自由なシリカの生産を最小限に抑えるために、迅速かつ一定のニキシングの下で組み合わせる必要があります。
インキュベーションの終わりにエタノールでチューブを充填し、反応を焼き、遠心分離によってナノスターを収集します。ペレットを乱さないよう注意して上清の最後の500マイクロリットルについて以外のすべてを吸引し、新鮮なエタノールの1ミリリットルでナノ粒子を再懸濁します。その後、溶液を1.5ミリリットルの遠心分離管に移し、遠心分離により4ミリリットルのエタノール洗浄を行い、各洗浄の間に約1秒間超音波処理してペレットを再懸濁する。
粒子表面にチオールを導入するために、最後の洗浄後、ペレットを85%エタノールの1ミリリットル、10%3-メルカプトプロピルトリメトキシシラン、および室温で1〜2時間のインキュベーション用の5%脱イオン水溶液に再懸濁した。インキュベーションの終わりに、指示されたように遠心分離によってチオール機能化ナノ粒子を洗浄し、洗浄間の超音波処理によってペレットを再懸濁する。抗体機能化抗葉酸受容体ナノプローブは、抗葉酸結合タンパク質抗体の200マイクログラムを、HEPESバッファーの500マイクロリットルでPEGクロスリンカーの10倍モル過剰と反応させる。
30分後に遠心フィルターに遠心分離により抗体を濃縮し、さらに遠心分離のためにフィルターを新しいチューブに反転させることにより抗体を回収する。次に、チオール機能化されたナノ粒子を濃縮抗体と混合し、室温で少なくとも30分間インキュベートする。非標的ナノプローブを形成するために、DMSOに溶解した5ミリグラムのメトキシ終止PEG5000マレインミドを、室温で少なくとも30分間のインキュベーションのために500マイクロリットルのHEPESバッファーでチオール機能化ナノ粒子に添加する。
ナノプローブ注入の場合、両方のナノプローブフレーバーをスピンダウンし、600ピコモラル濃度で新鮮なMESバッファー内のペレットを再懸濁します。ナノ粒子を混合し、得られた溶液の1ミリリットルをマウスあたり26ゲージの針を備えた1ミリリットルのシリンジにロードし、腹腔内に各マウスの腹部に全容を注入する。その後、腹部を穏やかにマッサージして、腹腔全体にナノ粒子を分配します。
少なくとも25分後、安楽死させた注入された動物の手足を外科用プラットフォームに固定し、鋸歯状鉗子と解剖ハサミを使用して皮膚を取り除き、腹腹を露出させる。腹部を切開する。腹膜フラップをプラットフォームに取り付け、少なくとも60ミリリットルのPBSで腹腔の内側を洗います。
次に、プラットフォームを直立光学構成と電動ステージでラマン分光光度計に転送し、適切なイメージングパラメータの下で腹部を画像化します。これは、ラマンスキャンのための焦点面が内臓の表面にあることが重要です。臓器が平面外にある場合、取得した信号は役に立ちません。
品質管理のために、ナノ粒子は、透過型電子顕微鏡、動的光散乱、ナノ粒子追跡解析、紫外線可視吸収分光法など、合成プロセス中に様々な方法を用いて特徴づけることができる。ラマン測定は、合成中のナノ粒子の各フレーバーのユニークなスペクトルの存在を明らかにします。典型的な反応収量および濃度は洗浄工程の間のピペットの技術に強く依存する。
ラマンスペクトルは、蛍光を除去するために処理し、古典的な最小二乗を適用する前に信号強度を補償するために単位面積に正規化することができます。各ナノプローブ基準スペクトルの古典的な最小二乗スコアは、個々に腫瘍の特定の位置を提供しないが、ポイントワイズ比は、広域顕微鏡広がりの存在を明らかにする。この手順を試みる間、ナノ粒子の品質が最終的な結果に強く影響を与えるため、合成のあらゆる段階でナノ粒子を検証することを忘れないでください。
この技術は、研究者が動物モデルにおける腫瘍関連マーカーの検出にSERRSナノプローブを使用し、高度な顕微鏡精度で患者組織を切除する可能性を示しています。
