이 양의 유세포 분석기 방법을 사용하여 연구자들은 막 상호 작용에 가져온 운동 및 평형 관습을 계산하고 PPH 막의 부위에 의해 가져온 단백질의 수를 추정 할 수 있습니다. 이 방법의 장점은 시약 및 장비의 단순성과 가용성입니다. 이 방법은 기본 연구를위한 것입니다.
이 프로토콜은 혈액 계산에서 단백질 지질 상호 작용을 연구하기 위해 개발되었으며 다양한 지질 막과 단백질의 상호 작용을 특성화하기 위해 다른 영역에서 사용될 수 있습니다. 상기 방법은 다양한 세포 및 리간드 유형에 대한 리간드 결합 역학의 수량 평가를 위해 사용될 수 있다. Tyrode's 완충액에 있는 인지질 소포를 하나의 마이크로몰 농도 및 250 마이크로리터의 총 부피로 희석하여 동역학적 결합 실험을 시작하십시오.
그 다음 형광 표지된 응고 인자 X 또는 FX FD와 500 나노몰의 농도를 인지질 소포와 일대일 비율로 혼합하여 총 부피 500 마이크로리터를 얻었다. 즉시 500 마이크로리터의 혼합 현탁액을 유세포 분석기에 주입한다. 여기 파장이 488 나노 미터이고 방출 필터가 585 나노 미터인 유속에서, 채널 FL 2의 경우 너비가 42입니다.
다음으로 633 나노미터에서 여기하고 20의 폭을 갖는 660 나노미터에서 방출 필터로 채널 FL 4에서 평균 형광을 측정한다. 결합의 포화가 달성되면 샘플을 Tyrode's 버퍼로 20배 빠르게 희석하고, 기준선 형광 또는 고원에 도달할 때까지 해리를 모니터링한다. 평형 결합 실험을 위해 20분 동안 티로데의 완충액에서 0에서 1000나노몰까지 FX FD의 다양한 농도를 갖는 다섯 마이크로몰 인공 인지질 소포를 인큐베이션한다.
인큐베이션 후 각 샘플을 Tyrode's 완충액으로 최종 부피 200 마이크로리터로 20배 희석한 다음, 희석된 샘플을 30초 이내에 유세포 분석기로 분석한다. 데이터를 분석하려면 FSC 형식의 실험을 세포측정 데이터 수집 소프트웨어에서 데이터 분석을 위한 세포계 소프트웨어로 내보냅니다. 파일을 선택한 다음 내보내기 및 FSC 파일 탭을 클릭합니다.
완료되면 컴퓨터에서 파일을 선택하고 파일을 프로그램의 작업 공간으로 드래그하여 FCS 파일을 세포계 소프트웨어로 엽니 다. 마이크로베시클을 게이팅하기 위해, 친유성 염료인 DIC 16 three의 형광에 의해 마이크로베시클의 영역을 확인한다. 그런 다음 워크시트의 플롯 단추를 사용하여 로그 좌표에 FL 두 D I C 16에서 점도표 SSC를 만듭니다.
그런 다음 직사각형 게이트 버튼을 선택하여 게이팅 영역을 그립니다. 동역학 실험을 분석하기 위해 소포의 영역에 대한 시간에 따른 형광의 좌표를 이용하여 점도표를 작성한다. 그런 다음 시간이 지남에 따라 형광 변화에 대한 데이터를 CSV 형식으로 내보내고 샘플을 선택하고 내보내기 탭을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭 한 다음 매개 변수에서 FL을 네 번 선택한 다음 저장할 디렉토리를 선택한 다음 CSV 형식 선택을 클릭하고 내보내기 탭을 누르십시오.
전송 후 통계 소프트웨어에서 CSV 파일을 열어 1000개의 이벤트마다 간단한 이동 평균 형광 및 시간을 계산하여 지수 의존성을 가정하여 시간에 대한 단일 이동 평균 형광의 의존성 그래프를 근사화하고 이 값을 사용하여 방정식을 사용하여 운동 연관 상수를 계산합니다. 그런 다음 앞에서 설명한 방정식을 사용하여 운동 해리 상수를 계산하십시오. 평형 결합 분석의 날짜를 분석하기 위해, FX FD의 선택된 각 농도에 대한 소포의 영역에서 FX FD의 평균 형광을 결정한 다음, 단일 부위 결합의 가정하에 첨가된 인자의 농도로부터 결합된 인자 형광의 의존성을 근사화한다.
최소한 세 개의 독립적인 반복으로부터 방정식을 사용하여 평균 결합 파라미터를 계산한다. 겔 여과된 혈소판을 실온에서 10분 동안 2.5 밀리몰 염화칼슘의 존재 하에 이십삼, 백팔십칠칼슘으로 인큐베이션하여 보정된 비드의 제조를 진행한다. 활성화된 혈소판이 FX FD의 다양한 농도를 첨가하고 혈소판을 두 부피 퍼센트 포름알데히드로 인큐베이션한다.
한 시간 후, 실온에서 30분 동안 3개의 몰 글리신 및 5%BSA로 혈소판을 인큐베이션함으로써 반응을 중지시킨다. 그 후 미반응 염료로부터 혼합물을 5분 동안 400배 G에서 원심분리하여 정제한다. 펠렛을 0.5%BSA를 함유하는 Tyrode's 완충액에 재현탁시키기 전에 상퍼네이트를 제거한다.
다음으로, 분광형광계를 이용하여 각 시료에서 교정 비드의 형광 수준을 측정한 다음, 유세포 분석기를 사용한다. 세포 카운터의 도움으로 각 샘플의 비드 수를 결정하십시오. 분광형광계를 이용하여 각 비드 시료의 형광 강도를 가용성 형광염료의 농도로 변환하고 분광형광계 분자의 수에 대한 형광염료 농도를 재계산한다.
각 샘플에 대한 플루로포어 분자의 수에 대한 유세포 분석기에서 비드의 평균 형광의 의존성 그래프를 작성한다. 그런 다음 분석 피팅을 사용하여 선 비례에 의한 의존성을 근사화하고 선형 탭을 순서대로 맞춥니다. 방정식의 근사치로부터, 평균 형광의 결합 부위로의 전환율을 계산한다.
나중에 관심 소포 당 결합 부위의 겉보기 수를 계산하십시오. 대표적인 분석은 혼입된 친유성 형광염료인 염료 IC16과 함께 1마이크로미터 크기의 인공 형광체 지질 소포의 게이팅을 보여주며, 게이트는 형광염료 없이 동일한 크기의 인공 지질 소포를 포함하는 샘플을 기준으로 설정되었다. 소포에 결합하는 단백질의 동역학을 샘플을 연속적으로 수집하여 첫 번째 단계에서 분석하였다.
얻어진 데이터는 유세포 분석기를 사용하여 분석하였다. 유세포 측정은 용액을 혼합하고 Tyrode의 완충액으로 희석 한 후 가능한 한 빨리 시작해야합니다. 제안 된 방법은 우수한 임시 해상도로 매우 민감하고 전달을 필요로하지 않는 막 상호 작용을 가져 오는 연구를위한 표면 플라즈마 공명으로 보완 될 수 있습니다.이 방법의 주요 장점은 접근성과 단순성입니다.
