この方法は、蛍光を使用して、合成膜間の生物学的に重要なリクリクドへのタンパク質転移が真核細胞内のこれらの脂質の分布に寄与するかどうかを判断する。この技術は、タンパク質による天然脂質の抽出および輸送を可能にし、作りやすくなる蛍光細胞やリポソームを必要とする。この方法を使用して、臓器と膜の間のいくつかの必須脂質の分布の背後にあるタンパク質によって細胞生物学への洞察を得るために変更することができます。
蛍光による脂質転写のリアルタイム測定を行う方法を説明するには、視覚的な実証が重要です。だから、手順を実証することは、私の研究室のエンジニアであるモード・マグデレーヌでもあります。新鮮なろ過体および脱ガス化されたHEPES酢酸カリウムバッファーを調製し、1ミリモル塩化マグネシウムを添加してHKMバッファーを形成します。
次に、PCのみで作られたリポソームを調製するか、または2つのモルパーセントPSまたはPI(4)Pで加減する。さて、フラスコをロータリーエバポレーターに置き、脂質を真空下で乾燥させます。1つの井戸では、2つのモルパーセントPSを含むリポソームを脂質センサーNBD-C2ラクトと混合し、最終的な濃度250ナノモルと100マイクロリットルの体積を混合します。
2番目のリポソームとNBD-C2の乳液を3つのミクロモル脂質転写タンパク質またはLTPと混合して十分に充填する。純粋な80マイクロモルPCリポソームと純粋な80マイクロモルPCリポソームと第4の井戸と混合250ナノモルNBD-C2の授乳で第三井戸を埋めます。これらの手順を繰り返して、3 つの追加の 4 つのウェルを準備します。
その後、蛍光リーダーにマルチウェルプレートを置きます。各井戸のために摂氏25度で490ナノメートルで励起時に5ナノメートルの帯域幅で505から650ナノメートルまでのNBDスペクトルを記録する。各系列では、他のスペクトルからリポソームのみで記録されたスペクトルを差し引きます。
PI(4)P抽出アッセイは、2つのモル%ホスファチジルイノシトール-4-リン酸でドープされたリポソームを調製し、NBD-PH FAPPプローブで測定を行います。制御実験を行い、抽出率を決定します。押し出しリポソームを終了した後、これらの押し出されたリポソームでチューブを充填します。
脱ガスし、ろ過されたHKMバッファーを準備し、室温で押し出されたリポソームを含むチューブを保ちます。ローダミンとラベル付けされたフォダミンを含むリポソームを含むチューブをアルミニウム箔で包み、不透明な箱に入れて写真の漂白を防ぎます。25~37°Cの温度を設定し、1~3ナノメートルの短い帯域幅で励起モノクロメーターを460ナノメートルに調整し、10ナノメートル以上の大帯域幅を持つ530ナノメートルに発光します。
取得時間を 25 分に設定し、時間分解能を 1 秒に設定します。クオーツキュベットでは、LAリポソーム懸濁液とNBD-C2ラクトストック溶液とプリウォームHKMバッファーの30マイクロリットルを希釈し、200マイクロモル総脂質および250ナノモルまたはNBD-C2ラクトを含む570マイクロリットルサンプルを調製した。小さな磁気攪拌バーを追加し、フルオロメーターホルダーにキュベットを配置します。
サンプルが熱的に平衡化されると、測定をトリガします。1分後、LBリポソーム懸濁液を30マイクロリットルのサンプルに加えます。3分後にLTPの最終濃度が200ナノモルになるようにサンプルにLTPを注入し、次いで残りの21分間信号を取得する。
並列実験を行い、NBD信号を正規化します。30マイクロリットルのLA平衡リポソーム懸濁液をHKMバッファに250ナノモルNBD-C2ラクトと570マイクロリットルの最終体積で混合します。1分後、LB平衡リポソーム懸濁液を30マイクロリットル注入する。
関心のある LTP で測定した運動曲線を変換して、時間の経過とともに LA から LB リポソームに転送される PS の量を決定します。次に、曲線の各データポイントを正規化します。PS転送アッセイと同じフロアエミッタ設定と条件を使用して、PI(4)P実験を行います。
キュベットでは、lbリポソーム懸濁液の30マイクロリットルとNBD-PH FAPPプローブを、あらかじめ温めたHKMバッファと混合し、570マイクロリットルの最終容積を得る。サンプルの熱平衡に達したら、測定を開始します。1分後、LAリポソーム懸濁液を30マイクロリットル注入する。
3分後、目的のLTPを注入し、信号を記録します。NBD信号を正規化するために2回目の実験を行います。250ナノモルNBD-PH FAPPとHKMバッファーの570マイクロリットルとlb平衡リポソーム懸濁液の30マイクロリットルを混合します。
1分後、30マイクロリットルのLA平衡リポソーム懸濁液を注入する。運動曲線を変換して、時間の経過とともにLBからLAリポソームに転送されるPI(4)Pの量を決定し、各データポイントを正規化します。LTP がどの程度効率的かを定量化する。
移動動力学の第1のデータ点の線形回帰を行い、傾きを得る。反応混合物中のLTP濃度でスロープ値を割り、時間単位当たりのタンパク質当たりの脂質分子の数を決定する。ビーズからのC2ラクタルの効率的な回収は、SDSページ分析で検証された。
NBDで標識されたC2ラクタルの紫外線可視吸収性スペクトルは、全てのC2ラクト分子がNBD基で標識されていることを確認した。NBD-C2の乳液の純度およびその蛍光は、SDSページ分析によって決定された。NBD-C2ラクタルまたはNBD-PH FAPPの蛍光は、PSまたはPI(4)Pを含むリポソームのみをインキュベーションに使用した場合に最大であり、センサーが膜結合していたことを示す。
このタンパク質がリポソームからPSまたはPI(4)Pを効率的に抽出したことを示すOsh6pが存在する場合、低蛍光が見られました。OSH6pをLTPとして用いたPS転写アッセイの結果を示す。PSの平均運動曲線を、LAリポソームからLBリポソームへの移行、ドープ、またはホスファチジルイノシトール-4-リン酸でドープしていないものを算出した。
平均初期PS輸送速度は、3つの異なる実験から決定した。同様に、OSH6pをLTPとして用いたPI(4)P転写アッセイの結果を以下に示す。シグナルの正規化後に得られる平均運動曲線と共に。
平均転写率は、PSでドープされたか、またはドープされなかったLAリポソームで測定された。このプロトコルを実行する場合は、新しいバッファを使用し、同じ日を準備します。豊富なリポソームやタンパク質の光の広がりを最小限に抑え、よく精製されたNBD標識タンパク質を使用し、氷の上に保管してください。遺伝子組み換え蛍光脂質センサを用いて、原核細胞内の細胞内でPSとPI(4)Pの移動を測定することで確認できます。
この技術は、PSとPI(4)がセル内に分布し、それらの活性が複数のLTPSの特異性を受けるというより良い理解への道を開く。
