Usando esse método de citometria de fluxo de quantidade, os pesquisadores podem calcular os costumes cinéticos e de equilíbrio da interação com a membrana e estimar o número de proteínas trazidas por locais na membrana PPH. As vantagens deste método são a simplicidade e disponibilidade de reagentes e equipamentos. Este método é exclusivamente para pesquisas básicas.
O protocolo foi desenvolvido para estudar interações lipídicas proteicas no cálculo sanguíneo, podendo ser utilizado em outras áreas para caracterizar a interação de proteínas com várias membranas lipídicas. O método pode ser usado para a avaliação da quantidade de dinâmicas de ligação de ligantes nos vários tipos de células e ligantes. Inicie os experimentos de ligação cinética diluindo vesículas fosfolipídicas no buffer de Tyrode para uma concentração de um micromolar e um volume total de 250 microlitres.
Em seguida, misture o fator de coagulação fluorescente X ou FX FD e uma concentração de 500 nanomolar com as vesículas fosfolipídidas em uma razão de um para um para obter um volume total de 500 microlitres. Injete imediatamente 500 microliters da suspensão mista no citômetro de fluxo. A uma taxa de fluxo com um comprimento de onda de excitação de 488 nanômetros e um filtro de emissão de 585 nanômetros; com uma largura de 42 para o canal FL dois.
Em seguida, meça a fluorescência média no canal FL quatro com excitação a 633 nanômetros e filtro de emissão a 660 nanômetros com uma largura de 20. Quando a saturação da ligação é alcançada rapidamente dilui a amostra 20 vezes com o tampão de Tyrode, e monitora a dissociação até que uma fluorescência de linha de base, ou um platô, seja atingida. Para experimentos de ligação de equilíbrio incubam cinco vesículas fosfolipícidas artificiais micromolar com concentrações variadas de FX FD de zero a 1000 nanomolar no buffer de Tyrode por 20 minutos.
Após a incubação diluir cada amostra em 20 vezes para um volume final de 200 microliters com tampão de Tyrode, então analise a amostra diluída por citometria de fluxo dentro de 30 segundos. Para analisar os dados, exporte os experimentos em formato FSC do software de aquisição de dados de citometria para software de citógrafo para análise de dados. Escolhendo o arquivo e, em seguida, clicando nas guias de arquivos de exportação e FSC.
uma vez feito abrir os arquivos FCS em software de citrômetro selecionando os arquivos no computador e arrastando os arquivos para o espaço de trabalho do programa. Para gating dos microvesículos, identifique a região dos microvesículos por fluorescência do corante lipofílico, DIC 16 três. Em seguida, use o botão plot na planilha para criar um SSC de gráfico de pontos a partir de FL dois D I C 16 em coordenadas de log.
Em seguida, escolha o botão de portão retangular para desenhar uma região de gating. Para analisar os experimentos cinéticos, crie um gráfico de pontos usando as coordenadas da fluorescência ao longo do tempo para a região das vesículas. Em seguida, exporte os dados sobre a alteração da fluorescência ao longo do tempo no formato CSV;escolhendo a amostra e clicando com o botão direito do mouse na guia de exportação, seguido de escolher FL quatro vezes em parâmetros, selecionar diretório para salvar antes de clicar no formato CSV selecionado e acertar a guia de exportação.
Após a transferência, abra o arquivo CSV em software estatístico para calcular a simples fluorescência e tempo da média móvel para cada 1000 eventos aproximam um gráfico da dependência da fluorescência média móvel única no tempo sob a suposição de dependência exponencial e usar o valor para calcular a associação cinética constante usando uma equação. Em seguida, calcule a constante de dissociação cinética usando a equação como descrito anteriormente. Para analisar a data do ensaio de vinculação de equilíbrio, determine a fluorescência média do FX FD na região das vesículas para cada concentração selecionada de FX FD e, em seguida, aproxime-se da dependência da fluorescência fator vinculado da concentração do fator adicionado na suposição de vinculação de local único.
Calcule os parâmetros de ligação médio usando uma equação de três repetições independentes no mínimo. Prossiga para preparar contas calibradas incubando plaquetas filtradas em gel com cálcio IANA 4A vinte e três, cento e oitenta e sete na presença de 2,5 milimilas de cloreto de cálcio por 10 minutos à temperatura ambiente. As plaquetas ativadas adicionam as várias concentrações de FX FD e incubam as plaquetas com dois por cento de formaldeído.
Após uma hora, pare a reação incubando as plaquetas com três glicina molar e 5%BSA por 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, purifique a mistura do corante não redigido com centrifugação a 400 vezes G por cinco minutos. Remova o supernato antes de reutilizar a pelota no buffer de Tyrode contendo 0,5% BSA.
Em seguida, meça o nível de fluorescência das contas de calibração em cada amostra usando um espectrômetro e, em seguida, usando o citômetro de fluxo. Determine o número de contas em cada amostra com a ajuda de um contador celular. Converta a intensidade da fluorescência de cada amostra de contas respectiva para a concentração de corante fluorescente solúvel usando um espectrômetro e recalcula a concentração de corante fluorescente para o número de moléculas de espectrofluorômetro.
Crie um gráfico de dependência da fluorescência média das contas em um címetro de fluxo sobre o número de moléculas fluróforas para cada amostra. Em seguida, aproxime-se da dependência por proporcionalidade de linha usando o encaixe da análise e ajuste as guias lineares em ordem. A partir da aproximação na equação, calcule o fator de conversão da fluorescência média para locais de vinculação.
Mais tarde, calcule o número aparente dos sites vinculantes por vesícula de interesse. A análise representativa mostra o brilho das vesículas lipídicas de fósforo artificial que têm um micrômetro de tamanho com o corante fluorescente lipofílico incorporado, corante I C 16, o portão foi definido com base em uma amostra contendo vesículas lipídicas artificiais do mesmo tamanho sem o corante fluorescente. A cinética da proteína que liga as vesículas foi analisada no primeiro estágio coletando a amostra continuamente.
Os dados obtidos foram analisados por meio de citometria de fluxo. As medidas citométricas de fluxo devem começar o mais rápido possível após a mistura das soluções e diluição com o buffer de Tyrode. O método proposto poderia ser complementado com ressonância plasmática superficial para estudos trazidos em interações de membrana que é altamente sensível com boa resolução temporária e não requer entrega A principal vantagem deste método é sua acessibilidade e simplicidade.
