コメットアッセイは、遺伝毒性の評価に広く使用されています。私たちのプロトコルは、標準的なコメットアッセイに比べて多くの方法論的利点を提供します。当社の技術は、標準的な彗星スライドを垂直に保持し、専用のラックで25個のバッチで処理することに重点を置いています。
これには電気泳動が含まれるため、タンクは小さく、使用するバッファーが少なく、冷却機能が統合されています。ラックに保持されているため、スライド上の繊細なゲルはより保護され、25秒で溶液から溶液へと移動します。私たちの血液彗星プロトコルを使用すると、研究者は血液のピン刺しを使用して、人間、他の種、およびさまざまな潜在的に遺伝毒性のある環境曝露のDNA損傷を研究できます。
顕微鏡スライドをコメットゲルの固体支持体として使用するコメットアッセイのさまざまなフォーマットは、いずれも私たちのアプローチに適しています。この手法の重要な部分は、LMPアガロースと混合した後にサンプルをロードすることです。サンプルは泡を立てずにすばやくロードし、固化する前にすぐにカバースリップで覆う必要があります。
まず、PBSで0.6%低融点アガロースを調製し、摂氏37度の水浴に入れます。プレコートされたスライドのつや消しの端に、油性マーカーまたは鉛筆を使用して、名前、日付、および処理情報のラベルを付けます。平らなベンチに冷却プレートを置き、2つの凍結冷却パックを金属表面の下のスライド引き出しに挿入します。
次に、スライドを冷却プレートに置き、1〜2分間プレチルします。遠心分離してサンプルチューブから上清を取り除き、すぐに氷上に戻します。セルペレットを200マイクロリットルの0.6%低融点アガロースで再懸濁し、ピペッティングで混合します。
次に、80マイクロリットルのアガロース含有細胞を冷やしたスライドに加え、ゲルの上にカバースリップをすばやく置きます。ゲルを冷却プレートに1〜2分間セットします。その間に、溶解バッファーの500ミリリットルの作業溶液を調製し、それを溶解皿に注ぎます。
ゲルが固まったら、親指と人差し指でスライドをそっと持ち、カバースリップをゲルからスライドさせて、カバースリップをすばやく取り外します。次に、スライド上のすべての黒い点マークが同じ方向を向くようにスライドキャリア内にスライドを配置します。スライドキャリアを溶解皿の中に置きます。
溶解皿の蓋を閉めて、インキュベーションのために置きます。ゲルを乱すことなく、スライドキャリアを溶解皿から慎重に取り外します。スライドキャリアを、氷冷した二重蒸留水があらかじめ入った洗浄皿にそっと置きます。
スライドが完全に水没していることを確認し、セットアップを30分間そのままにします。電気泳動タンクの下に凍結冷却パックを置き、最適なバッファー温度を維持します。次に、氷冷電気泳動作業溶液をタンクに加え、スライドキャリアをタンクに移します。
細胞含有ゲルがカソードの方を向くようにスライドの向きを合わせます。スライドを電気泳動タンクで20分間インキュベートし、DNAをほどきます。次に、電源を入れて、1.19ボルト/センチメートルで20分間電気泳動を実行します。
電気泳動が完了したら、電源を切り、スライドキャリアを電気泳動タンクから取り外します。スライドキャリアをティッシュペーパーに30秒間排出します。次に、スライド担体を中和緩衝液の入った皿に入れ、20分間放置します。
これに続いて、氷冷した二重蒸留水を入れた洗浄皿に入れ、20分間放置します。洗浄後、スライドキャリアを水から取り出し、スライドを摂氏37度のインキュベーター内で1時間乾燥させます。スライドをリハイドレートするには、スライドキャリアを氷冷した二重蒸留水を含む洗浄皿に移し、30分間放置します。
次いで、スライド担体を、1ミリリットル当たり2.5マイクログラムのヨウ化プロピジウム溶液を含む染色皿に入れる。染色皿の蓋を閉め、室温で暗所で20分間インキュベートします。インキュベーション後、スライド担体を別の皿に移し、氷冷二重蒸留水で20分間洗浄する。
スライドキャリアを皿から取り出し、摂氏37度のインキュベーターまたは室温で暗所で完全に乾かします。スライドが完全に乾いたら、画像分析の準備ができるまで暗所のスライドボックスに保管します。ヒトケラチノサイトに異なる用量のUVAおよびUVBを照射するか、または50マイクロモルの過酸化水素で処理してDNA損傷を誘発した。
最適な電圧は1.19ボルトセンチメートルで、最も敏感な応答と尾のDNAの最大の割合を誘発します。ヒト全血に異なる用量のUVAを照射し、異なる濃度のFpgで処理した。 ハイスループットアルカリコメットアッセイは、Fpgのミリリットルあたり4単位のDNA損傷の最適レベルが誘発されることを明らかにした。
卵巣癌細胞株SK-OV-3をシスプラチンと過酸化水素の組み合わせで処理した。ばく露されていない細胞は損傷を示さなかった。過酸化水素のみへの曝露は、DNA鎖内架橋が誘導された細胞と比較して有意な平均オリーブテールモーメントを生成しました。
100マイクロモルのシスプラチンで処理した後、DNA鎖内架橋は12時間でピークで増加し、その後、レベルは30時間後にゼロに減少しました。 電気泳動の前に、アイスパックを電気泳動タンクに入れ、スライドを20分間インキュベートしてDNAを巻き戻すことが不可欠です。このステップは、損傷したDNAが電流で移動するのを助けます。スライドを垂直に配置してアッセイを実行することで、コメットアッセイを自動化することができました。
さらに、私たちの技術は研究のための彗星アッセイを簡素化しました。
