この作品は、国立科学財団助成MCB-0718846および米国防総省の国防高等研究計画庁（JDBに）契約N66001-12-C-4020によって部分的にサポートされていました。 LAMは、自然科学とカナダの工学研究評議会からのポスドクフェローシップによって資金を供給されました。この記事の公開は、ロシュが主催されています。

1.酵母ゲノムDNA（gDNAを）を準備<ol><li> 50mMトリスpH8.0の、100mMのNaCl、1％SDSを含んでいる酵母溶解緩衝液9のストックを調製し（W / V）、2％トリトンX-100（v / v）、1mMのEDTA pHは8.0。 </li><li>材料の使用を開始するなど、通常BY4741 10背景の実験室株について飽和文化の〜100μlに対応〜2×10 6細胞、。培養した細胞を1.5mlのマイクロチューブ中で室温で3分間、1000×gの遠心分離によって収集されるべきです。上清を吸引除去します。 </li><li>酵母溶解緩衝液200μlを加え、ピペッティングにより細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>酸の〜300μlをビーズのレベルは約1mm細胞スラリーのレベル以下であるようなガラスビーズを洗浄しました。 </li><li>ドラフト内（25：24：1）をフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール200μlを添加します。マイクロチューブに蓋をし、この揺れの間に漏れになりますように何のビーズがキャップとチューブの間に立ち往生していないことを確認（ステップ1.6）。混合し、キャップが密封されていることを確認するために3回転倒。 </li><li>例えば、エッペンドルフ5432などのベンチトップミキサーを用いて室温で10分間チューブを振ります。 </li><li> 4℃で10分間、20,800×gで遠心分離します。 </li><li> 100％エタノール1 mlを含む新しいマイクロチューブに移し、水相の75μLを。混合するために10回転倒。 </li><li> 4℃で20分間、20,800×gでの遠心分離によってDNAをペレット化。 </li><li> DNAペレットを外れることなく、上清を吸引除去します。 70％エタノール500μlでペレットを洗浄します。 </li><li> 4℃で5分間、20,800×gで遠心分離します。 </li><li> DNAペレットを取り除くと、通常、約10分である過剰のエタノールが蒸発するまで、オープンマイクロフュージキャップ、とのペレットを空気は、乾燥することなく、上清を吸引除去します。 </li><li>混合するために10mMのトリスpH7.4の渦の75μlのDNAペレットを再懸濁します。無期限に-20℃でサンプルを保管してください。用いて試料中のDNAの濃度を測定しますこのようなRNAからDNAを区別量子ビットとして、ベンチトップ蛍光光度。のgDNAの最終濃度は〜1-2 ng /μLであることを確認してください。 </li><li>混合するために、水とボルテックスを用いてゲノムDNAの1:10希釈液を調製します。 </li><li>小分けナノスケール音響液体ディスペンサー（ステップ3）と互換性のあるソースプレートの適切なウェルに希釈したgDNAの30μlの。 Labcyteエコー550を使用している場合は、384ウェルポリプロピレンプレート（384PP板）を使用します。 注：適切に密封されたときに、このプレートを-20℃で少なくとも1ヶ月間保存することができます。 </li></ol> 2. 1536マルチウェルプレートに準備し、ディスペンス定量PCRマスターミックス<ol><li>混合するために1.5mlマイクロチューブと渦では、このようなライトサイクラー1536 DNAグリーンマスターとして定量PCRマスターミックスの850μLを、準備します。任意の気泡を除去するために、室温で20,800×gで2分間、定量PCRマスターミックスを遠心します。シングル1,536マルチウェルプレートに必要な定量PCRマスターミックスの成分は以下の通りですS： <ol><li>酵素マスターミックス（濃縮グリーンマスターチューブ1、5倍）、SYBR 42.5μlの（20倍濃縮されたグリーンマスターチューブ4）の170μlを、水637.5μLを兼ね備えています。 </li></ol></li><li>このようなアート·ロビンスコブラなどのバルク液体ディスペンサーを用いて十分に1,536マルチウェルプレートへ/ 500 nlの分注します。 （手順は、2.2.1-2.2.4コブラに特異的に参照することに注意してください。） <ol><li>次の設定でディスペンシング·プログラムを作成します。液体クラス、水;吸引量、800μlの。ボリューム、500 NLを分配します。時間、20秒を洗います。ディスペンスの設定では、分注速度は49.6ミリメートル/秒に設定されていることを確認し、オフセット分注は0.25ミリメートルであり、過剰な吸引液が十分に戻って元に分配されます。 </li><li>マイクロチューブのキャップを切断したり、単にオープンのままにデッキ1位に位置しているマイクロチューブホルダー、ウェルA1での定量PCRマスターミックスを含むマイクロチューブを置きます。 Aspiratを編集して、A1に「よく吸引する」に設定しE設定。 </li><li>前の最初の脱選択吸引によって定量PCRマスターミックスを分注する洗浄工程を行い、ステップ2.2.2で設定プログラムのステップを分配した後、「実行」を打ちます。完了したら、吸引を再選択して、定量PCRマスターミックスを分注するための完全なプログラムを実行する前にステップを分配します。コブラは、プライムシステムに提供しています10分未満の初期洗浄工程、アイドル状態に座っている場合は、不要です。 </li><li>各ウェルに定量PCRマスターミックスを分配するために「実行」を押してください。 </li></ol></li><li> 1536マルチウェルプレート（低速PCRプレートスピナーを使用して、30秒）を簡単に遠心分離することにより、各ウェルの底の定量PCRマスターミックスを収集します。 </li></ol> 3.ディスペンス鋳型DNAと1,536マルチウェルプレートにプライマー<ol><li>このようなエコー550のような音響液体転送システムを使用して、1536マルチウェルプレートの所望のウェルに希釈したgDNAの5 NL（ステップ1.3）を分注します。 <ol><li> ECHのため550 O、プレートの再フォーマットソフトウェアを使用するか、または代替的に転送をプログラムするために、カスタムのExcelスプレッドシートを提供しています。プログラムは、あなたが物理的にgDNAを（ステップ1.3）を分配しているだけでなくその中にソースに一致でのgDNAのためによく選択されたソースを確認してください。 384PP板内の液体は、界面活性剤を含まない緩衝液であることを示すソースプレートタイプ &#39;384PP_AQ_BP2&#39;を選択します。 </li></ol></li><li>プライマー、フォワードプレ混合し、例えば、エコー550のような音響液体移送システムを使用して1536マルチウェルプレートの所望のウェルに50μMのそれぞれの最終濃度に逆の10 NLを分注します。 <ol><li>液体転送システムでは、プレートの再フォーマットソフトウェアを使用するか、または代替的に転送をプログラムするために、カスタムのExcelスプレッドシートを提供しています。 注：ここでは、それは簡単ですので、1,536マルチウェルプレート上のレイアウトを視覚的にリアルタイムPCRの結果を検査するためのプライマーの染色体順に一致するようにプライマーを省くことが可能です後で（ステップ6）。 </li><li>音響液体ディスペンサーと互換性のある板にプライマーをプレミックス。エコー550は、Labcyte 384LDV（低デッドボリューム）プレートを使用し、ソースプレートタイプ &#39;384LDV_AQ_B」液体がないタンパク質との単純なバッファであることを示すためにエコーをプログラムを選択します。 </li></ol></li></ol> 4.シールと遠心1536マルチウェルプレート<ol><li>このようなPlatelocサーマルマイクロプレートシーラーなどのマイクロプレートシーラーシステムを使用して、すぐにヒートシーラー機器と互換性のある光学的に透明なシールを使用して、1,536マルチウェルプレートをシール。汚れマークを回避するために、シールの表面には触れないでください。 <ol><li> Platelocサーマルマイクロプレートシーラーを使用している場合は、次の設定を使用します。時間を2.0秒、シール温度162℃で、空気の圧力82 PSIをシール。この装置は、加熱するために〜5分かかりますので、事前にオンにする必要があります。 </li><li> Platelocサーマルマイクロプレートシーラーを使用している場合、adapterは良好なシールを確実にするために、機器の段階に1536マルチウェルプレートの高さを上昇させるために使用されなければなりません。 注：それはPlatelocサーマルマイクロプレートシーラー用のステージプレートを購入するのが好ましいが、別の解決策は、1,536マルチウェルプレートの高さを上げるために隅に任意のハードウェア店で入手可能な4〜2mmの厚さの標準的なワッシャを挿入することです。 </li></ol></li><li>すぐに、各ウェルの底にすべての試薬を収集するために、室温で3分間、2,000×gで密封された1,536マルチウェルプレートを遠心します。 </li></ol> 5.リアルタイムPCR <ol><li>プログラム融解曲線分析に続く二段階増幅プロトコルなどライトサイクラー1536として1536のqPCR器具。次のようにプログラムを設定、ライトサイクラー1536ソフトウェアを使用しました： <ol><li>プレインキュベーション：95℃、1分間保持、ランプ速度4.8℃/秒、ない取得。 </li><li>二段階の増幅：[95℃の30サイクル、ノーホールド、ランプ速度4.8℃/秒、ノー取得。 64℃、30秒のホールド、ランプ速度2.5℃/秒、単一の取得]。 </li><li>溶融曲線：95℃、10秒、ランプ速度4.8℃/秒、ノー取得。 60℃、1分、ランプ速度2.5℃/秒、ノー取得。 97°C、ランプ速度0.1℃/秒、5買収/°C（連続）。 </li><li>クール：40℃、30秒、ランプ速度2.5℃/秒、ない取得。 </li></ol></li><li>ファイル名を指定して実行定義]タブで「グリーンインターカレー色素 &#39;に検出形式を設定します。 </li><li>ファイル名を指定して実行定義]タブで「マスター·コントロール」にピペッティング制御を設定します。この機能は、内部対照として機能し、推定上の偽陰性を同定するのに有用である1,536マルチウェルプレートの各ウェル中のqPCRマスターミックスの存在を検出します。 </li><li> 1,536定量PCR機器にステップ2-4で製造した1536マルチウェルプレートを挿入し、プログラムを実行します。 </li></ol> 6.データ解析<ol><li> PERFqPCRのソフトウェア内のデータの目視検査をORM。 注：1,536ソフトウェアは、両方の増幅の可視化を可能にし、曲線、ならびにコール（正、負、無効、N / A; 図2）を示すヒートマップを溶融、交差点の値が（正またはグレーのカラースケールをスライディング図3）、またはエンドポイントの蛍光カラースケールをスライド（EPF）の値（）;負のため。 </li><li>生データや楽器からオフラインで処理するための計算されたデータのいずれかとの1536形式のソフトウェア.txtファイル（結果表）または.xmlファイルからデータをエクスポートします。 注：高い信頼性で正/負とCp値の呼び出しを決定しながら、1536ソフトウェアに組み込まれている独自の自動化されたクロスポイント（CP）を呼び出すアルゴリズムは比較的低いと低いサブマイクロリットルの反応容量で、アカウントに形状や増幅曲線の傾きをとります蛍光値。 </li><li>ライトサイクラーDNAグリーンマスターが使用した場合定量PCRのためのdは、すべてのウェルが「マスターコントロール」を渡されていることを確認します。失敗は、よくは定量PCRマスターミックスと欠落したデータポイントを受信しませんでした示し潜在的偽陰性とみなされるべきです。全てのウェルは、「マスターコントロール」を渡されたことを確認します。失敗は、よくは、DNAのマスターミックスを受信し、欠落したデータポイントの潜在的な偽陰性を考慮していないを示しています。 </li></ol>

<ol>
	<li>Annaluru, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+synthesis+of+a+functional+designer+eukaryotic+chromosome.">Total synthesis of a functional designer eukaryotic chromosome.</a> Science. 344 (6179), 55-58 (2014).</li><li>Dymond, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+chromosome+arms+function+in+yeast+and+generate+phenotypic+diversity+by+design.">Synthetic chromosome arms function in yeast and generate phenotypic diversity by design.</a> Nature. 477 (7365), 471-476 (2011).</li><li>Goffeau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+with+6000+genes.">Life with 6000 genes.</a> Science. 274 (5287), 546-547 (1996).</li><li>Dymond, J., Boeke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Saccharomyces+cerevisiae+SCRaMbLE+system+and+genome+minimization.">The Saccharomyces cerevisiae SCRaMbLE system and genome minimization.</a> Bioeng Bugs. 3 (3), 168-171 (2012).</li><li>Richardson, S. M., Nunley, P. W., Yarrington, R. M., Boeke, J. D., Bader, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GeneDesign+3.0+is+an+updated+synthetic+biology+toolkit.">GeneDesign 3.0 is an updated synthetic biology toolkit.</a> Nucleic Acids Res. 38 (8), 2603-2606 (2010).</li><li>Richardson, S. M., Liu, S., Boeke, J. D., Bader, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design-A-Gene+with+GeneDesign.">Design-A-Gene with GeneDesign.</a> Methods Mol Biol. 852, 235-247 (2012).</li><li>Lajoie, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+limits+of+genetic+recoding+in+essential+genes.">Probing the limits of genetic recoding in essential genes.</a> Science. 342 (6156), 361-363 (2013).</li><li>Jovicevic, D., Blount, B. A., Ellis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+synthesis+of+a+eukaryotic+chromosome:+Redesigning+and+SCRaMbLE-ing+yeast.">Total synthesis of a eukaryotic chromosome: Redesigning and SCRaMbLE-ing yeast.</a> Bioessays. 36 (9), 855-860 (2014).</li><li>Dymond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+genomic+DNA+from+Saccharomyces+cerevisiae.">Preparation of genomic DNA from Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Enzymol. 529, 153-160 (2013).</li><li>Brachmann, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+deletion+strains+derived+from+Saccharomyces+cerevisiae+S288C:+a+useful+set+of+strains+and+plasmids+for+PCR-mediated+gene+disruption+and+other+applications.">Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications.</a> Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).</li></ol>

LAM、NAP、JAMとJDBは開示することは何もありません。 RCとALは、ロシュ·ライフサイエンス社、米国を採用し、原理実験の証拠の一部としてLAMを使用してアプリケーションを開発する上で加工されます。

それが顕著に高いスループットを可能にするようPCRTagジェノタイピングアッセイにリアルタイムPCR検出の組み込みはSc2.0プロジェクトのための重要な開発です。前のワークフローでは、384ウェルPCRプレート、1.5時間、熱サイクルの実行時間、アガロースゲル電気泳動、およびゲルの手動注釈に2.5μlの反応を指定しました。 qPCRTag分析と呼ばれるここで紹介するワークフローは、いくつかの主要なボトルネックを克服しています。まず、qPCRTagランは約1時間で、（プレートのセットアッププラス時間を実行します）最初から最後まで、加工することができる単一の実験中に4×384ウェルプレートを凝縮します。それはqPCRTag分析用ウェルあたり試薬コストが低いスループットアガロースゲルベースの​​アプローチと同等のことに留意することが重要です。しかし、ゲル電気泳動および手動注釈を回避することによって、qPCRTagワークフローは大きな利点であり、時間と労力の大幅な節約を、提供します。重要なことqPCRTagワークフローは専用ですオートメーションとtirely互換性があります。 PCRTagアッセイの出力としてリアルタイム検出を用いて、主要な関心事は、偽陽性と偽陰性の割合です。 PCRTagプライマーが最初にリアルタイムPCRでの使用のために設計されていないので、全てのプライマー対は、この出力での使用のために適切であることが期待されます。このためには、フロントアップ、リアルタイムベースのアッセイでは動作しないサブセットを除外するために、すべてのPCRTagプライマー対の機能と特異性を検証することが重要です。例えば、染色体3 PCRTag偽陽性及び陰性のバイ及び大再現性のあるリアルタイムPCRデータ（ 図2および図3）、これらはさらなる分析から除外することができます。また、失敗することが知られているプライマー対（ゲル電気泳動によって評価し、 図 ら AnnaluruのS6及びS7に示す。1）も排除することができます。これは、簡単にexclu単純に達成されます音響伝達プロトコルを設定丁不良プライマー対。 ほとんどのハイスループットアッセイのように、私たちはさらに下流の検証に値する形質転換体を同定するために、一次スクリーニングとしてリアルタイムPCRTag検出を使用します。続いて、二次スクリーニングのためのゴールドスタンダードは、読み出しとしてゲル電気泳動でPCRTag解析のままになります。 Sc2.0ためPCRTag解析の適用を超えて、ハイスループットで最先端のナノスケールの液体ハンドリングシステムを組み合わせたリアルタイムPCR技術は、迅速で自動化された分析を可能にし、多くの分野に影響を与える可能性を有します。たとえば、このワークフローは、ハイスループットライブラリースクリーニング、伝染病の診断、microbiome分析し、同時に複数の遺伝子座を変更しようとする最先端のゲノム編集手法に適用することができます。

Sc2.0、または合成酵母ゲノムプロジェクト（ <a href="http://www.syntheticyeast.org" target="_blank">www.syntheticyeast.orgは</a> ）、完全に合成真核生物のゲノムを設計し、構築することを目標としています。出発点として、 サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）3の高キュレーションゲノム配列を使用して、16リニア染色体のそれぞれは、セルの適性を維持し、ゲノム安定性の向上、および遺伝的柔軟性を増大させる特定の設計原理のセットに適合するように再設計されています。例えば、このような繰り返しのような不安定化要素はSc2.0染色体から削除されます。 TAG停止コドンのすべてのインスタンスは、非遺伝的にコードされたアミノ酸の導入のための最終的な株でコドンを「解放」するTAAに再符号化されます。またのCre-lox系で有効に誘導進化システム、スクランブルは、新規な構造4を有する誘導体ゲノムを生成するために、これまでにない能力を可能にします。 <p class=「jove_contentは &quot;&gt; Sc2.0ゲノム中のもう一つの主要な設計要素は、合成および野生型DNAの追跡を可能にするために、DNAの透かしとして機能PCRTags、の紹介です。 PCRTagsは、合成染色体上のORFで短い、再符号化されたセグメントです。 PCRTag配列は、合成および野生型の染色体間DNAレベルで異なるが、コードされたタンパク質は、アミノ酸配列、従って、おそらく、機能的に同一です。 PCRTag配列は、具体的に選択的増幅（ 図1A）を容易にするためのプライマー結合部位として設計されています。 PCRTag設計は、典型的には58°Cと60°Cとの間の融解温度を有する天然配列（最小33％）よりも〜60％異なる合成配列を再符号得GeneDesign 5,6中で最も異なる」アルゴリズムを使用して行われます200〜500塩基対2との間のアンプリコンの長さ。これらの領域はに知られているように再符号化は、各ORFの最初の100塩基対の中に許可されていませんコドン使用頻度7の面で特別な好みを持っています。一緒に、これらの設計ルールは、合成および野生型PCRTagプライマー対は、排他的に（ 図1B）は、それぞれ、合成および天然のDNAに結合し、増幅することによりPCR条件の単一セットの下で、ほとんどすべてのPCRTagsの高性能化に有利に働きます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig1.jpg" /> 図1：PCRTagの概略図（A）PCRTagsはSc2.0染色体上の遺伝子のオープンリーディングフレーム（ORF）内の配列を再符号化されます。 （B）の合成（SYN）と野生型（WT）PCRTagプライマーはもっぱら、それぞれ結合し、（のgDNA）を合成し、野生型ゲノムDNAを増幅します。ここに示されているテンプレートとしてWTまたは半synVIL2たgDNAのいずれかを使用して13 PCRTagプライマー対を試験、染色体6の左腕の約30 kbの断片の分析です。多くの場合、単一のORFは、複数のPを符号化しますCRTag。 PCRTagアンプリコンの存在/非存在は、アガロースゲル電気泳動によって評価します。 PCRTagアンプリコンは200 bpのから500塩基対のサイズの範囲。パネルの下部にあるより速く移動する種は、プライマー二量体です。 PCRTag分析はSc2.0染色体の組み立てにおいて重要なツールであることが証明されました。 20-30 PCRTagsをコードする合成DNAの典型的な実験30〜50キロバイトでは、対応する野生型DNA 1,2,8を置き換えるために酵母細胞に形質転換します。 PCRTag分析はその後DNAのセグメントにまたがる合成ではなく、野生型PCRTags、またはいわゆる「勝者」をコードする形質転換体を同定するために使用されます。これは、「勝者」を識別するために、複数の形質転換体を試験することが通常必要であるため、PCRTag分析のスループットおよびコストが重要な考慮事項です。現在、2 Sc2.0の染色体がSc2.0ゲノムの10％未満を表す、（synIII 1及びsynIXR 2）完了した、ALTハフより残りの染色体の半分以上は、現在、合成およびアセンブリを受けています。このプロジェクトに必要なPCRTag分析の規模は、高速合成DNAおよび野生型DNAの有無をゲルを実行して、手動で得点する能力を上回っています。 我々は、アガロースゲル電気泳動の使用を回避するために、リアルタイムPCRを使用してワークフローを開発したPCRTagアッセイのスループットを向上させます。ワークフローは、私たちはNL 500に反応を小型化することができ、1,536マルチウェルプレートの各ウェルにテンプレートDNAおよびプライマー、および1,536定量PCRサーマルサイクラーを転送するために、ナノスケール音響液体ディスペンサーを定量PCRマスターミックスを配布するバルク液体ディスペンサを利用し、スループットを最大化します。さらに分析を自動化することができます。ハイスループットジェノタイピングこのタイプのプロトコルは、複数の遺伝子座で多くのクローンの分析を必要とするプロジェクトに一般にする必要があります。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Yeast gDNA prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast gDNA</td>
			<td>custom</td>
			<td>custom</td>
			<td>template for real time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid-washed glass beads (0.5mm)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8772</td>
			<td>yeast cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15593-031</td>
			<td>yeast cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5432 Mixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5432</td>
			<td>yeast cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge 5417R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22621807</td>
			<td>yeast cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33216</td>
			<td>gDNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>gDNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labcyte 384PP plate</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td>P-05525</td>
			<td>gDNA source plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>DNA Green Mastermix prep and dispensing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 1536 DNA Green</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5573092001</td>
			<td>real time PCR mastermix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5mL Microfuge Tube Holder</td>
			<td>ARI</td>
			<td>EST BD060314-1</td>
			<td>microfuge tube holder for deck of Cobra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 1536 Multiwell Plate</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5358639001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobra liquid handling system</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
			<td>630-1000-10</td>
			<td>dispense qPCR master mix into 1536 plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Plate Spinner</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89184-608</td>
			<td>cenrifugation of 1536 plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Template and primer dispensing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCRTag primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td>custom</td>
			<td>premixed forward and reverse, [50uM] each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TempPlate pierceable sealing foil, sterile</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2923-0110</td>
			<td>temporary seal for PCRTag primer plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labcyte LDV 384 well plate</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td>LP-0200</td>
			<td>pre-mixed primer source plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Echo 550 Liquid Handler</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td></td>
			<td>transfer 2.5nL drops of primer and template DNA into 1536 plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plateloc Thermal Microplate Sealer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G5402-90001</td>
			<td>heat seal for 1536 plate prior to LC1536 run</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Permanent Seal</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>24212-001</td>
			<td>optically clear heat seal for LC1536 multiwell plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlateLoc Roche/LightCycler 1536 Plate Stage</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G5402-20008</td>
			<td>can substitute ~2mm thick washers&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend XTR</td>
			<td>Thermo Scientfic</td>
			<td>75-004-521</td>
			<td>centrifuge heat sealed 1536 plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Industrial Air Compressor</td>
			<td>Jun Air</td>
			<td>1795011</td>
			<td>to run the Echo and Heat Sealer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Real Time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 1536</td>
			<td>Roche</td>
			<td></td>
			<td>requires 220V outlet</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

qpcrtag analysis - a high throughput, real time pcr assay for sc2.0 genotyping

合成酵母ゲノムプロジェクト（Sc2.0）は16デザイナー酵母染色体を構築し、単一の酵母細胞にそれらを組み合わせることを目指しています。 1合成染色体、synIII 1、および1つの合成染色体腕、synIXR 2とデートするには、構築し、それらのインビボ機能は、対応する野生型の染色体の不存在下で検証されています。 Sc2.0染色体の重要な設計上の特徴は、それらの野生型対応物から合成染色体の分化を可能にするオープンリーディングフレーム（ORF）内の短い、再符号化された配列であるPCRTags、の紹介です。 PCRTagは合成または野生型のいずれかの染色体に選択的にアニールするプライマーおよびDNAの各タイプの存在/非存在は、単純なPCRアッセイを用いて試験することができます。 PCRTagアッセイの標準読み出しは、アガロースゲル電気泳動により、アンプリコンの存在/非存在を評価することです。しかし、1.5キロバイトとAgあたり1の平均PCRTagアンプリコン密度〜12 Mbののenomeサイズは、完成したSc2.0ゲノムは、およそ8,000 PCRTagsをエンコードします。スループットを向上させるために、我々はqPCRTag分析呼び出すPCRTagジェノタイピングのためのリアルタイムPCRベースの検出アッセイを開発しました。ワークフローは、私たちは1回の実験で合成および野生型プライマー対の両方で768 PCRTagsまでテストすることができ、1,536マルチウェルプレートで500 nlの反応を指定します。

我々は、4つの異なる株から抽出した酵母ゲノムDNA（gDNAを）で合成し、野生型染色体3 PCRTagプライマー対1を試験しました。 3番染色体は、染色体の長さにまたがる186 PCRTagプライマー対（synIIIがある〜270キロバイトと野生型の3番染色体がある〜315キロバイト）を有しています。両方のプライマーセットと4つの株のそれぞれを試験するために、我々は、下半分に各象限と野生型の上半分に合成PCRTagプライマーを割り当て、4つの象限、gDNAをそれぞれのタイプごとに1つにマルチウェルプレートを分割しました。ゲノムDNAは、残りの二つのコードする合成染色体3（synIII 1、synIII synIXR）が、野生型染色体3（野生型、synIXR 2）をコードするそのうちの2つの酵母株から抽出しました。定量PCRマスターミックスはで同じ配列したエコー550のプライマーを用いてのgDNAとPCRTagプライマーが続くバルク液体ディスペンサーを使用して、1,536マルチウェルプレートの各ウェルに分注しました。簡単に視覚的に比較するためのマルチウェルプレートの各象限。マルチウェルプレートは、次に、光学的に透明なシールで密閉し、リアルタイムPCR分析に供熱ました。 期待どおりにこのqPCRTag実験では、合成プライマーは、排他的に合成DNAおよびその逆に増幅することにより、大部分が、増幅のために、観察された（ 図2、図3）。しかし、我々はまた、データセット内の偽陰性および偽陽性を示唆して、期待値パターンからいくつかの偏差を観察しました。この実験では、マスターコントロールが正常ウェルプレート上のすべてにマスターミックスを分配バルク液体ディスペンサを示すウェルの100％で検出された（データは示さず）。これは、偽陰性の潜在的な原因を除外する。さらに、いくつかの染色体3 PCRTagsは（ 図 ら AnnaluruのS6およびS7に示す。1）失敗することが知られている、少なくとも2 SYNと1 WTを含みますプライマー対;したがって、これらのウェルを、各象限に無視することができます。真偽陰性が記載されているように、正しいエコー550のキャリブレーションなどのgDNAおよびプライマーの調製を与え、しかし我々の経験では、テンプレートのgDNAまたはプライマーの移動の欠如から生じる可能性があり、これがエラーの主な原因ではなかったです。全体的に、この実験では偽陰性率は、WTテンプレート（〜2％）SYN DNA（〜8％）でのSYNプライマーについて若干高いもののとWTのプライマーのための非常に低かったです。 偽陽性は、SYNプライマーは、WTのgDNA（およびその逆）と混合し、ウェル中のシグナルの検出は、クロス増幅またはプライマーダイマーから生じ得ます。確かに、プライマー二量体は、ゲル電気泳動（ 図1B）によって、多くの場合、表示され、エラーの合理的なソースを表しています。定量PCRの適用のために、融解曲線の試験は、プライマーダイマーなどの異なる種が、信号に寄与することができるかどうかを決定するために有用であり得ます。また、PERFプライマーは、鋳型DNAの非存在下で分配されることにより、対照実験をormingすると二量体化する傾向を有するプライマーを特定するのに役立ちます。あまりにも多くのPCRサイクルが実行される場合は、アニール温度が低すぎるとクロス増幅は、特に、ゲル電気泳動によって観察することができます。我々はqPCRTagプロトコルの両方のパラメータを最適化することによって、クロス増幅に起因する偽陽性の数を最小限にしようとしました。最後に、各ウェルについて交差点（CP）の値を検査することは、リアルタイムベースの検出（ 図3、 例えば、BB22、Fb22、Bb46、Fb46）に適していないプライマーを特定するのに役立ちます。全体的に、この実験では、偽陽性率は、SYNテンプレート（〜10％）とWTプライマーのためのWTテンプレート（〜5％）と高いとSYNのプライマーについて低かったです。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig2.jpg" /> 図2：プレートヒートマップ表示するプレゼンス/ ABqPCRTag実験のためのローミングサービスコール。SYNを分離するために白い破線ゲノムDNA（象限は、固体白い線で区切られた）合成（SYN）を使用してPCRTag分析に供したおよび野生型（WT）3番染色体PCRTagプライマー（4つの異なるタイプ（トップ各象限内）とWT（下））。 WTとsynIXRのgDNAは、WT PCRTagプライマーで増幅を得、野生型染色体3をコードする。synIIIとsynIII synIXRのgDNAがSYN PCRTagプライマーで増幅を得、合成染色体3をコードします。プライマーは、その左から右への染色体の位置に応じて並べて比較のための4つの象限で同じ位置している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52941/52941fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig3.jpg" /> 図3：プレート熱クロスポイント（CP）qPCRTag実験の値を表示するマップが、これは、図2と同一のデータセットであり、プレートレイアウトは、したがって、同一です。 N / A &#39;は増幅なし」を意味する。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52941/52941fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a>

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qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag分析 - 高スループット、Sc2.0ジェノタイピングのためのリアルタイムPCRアッセイ

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.8K ビュー.  Institute for Systems Genetics. Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

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A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

神経毒性の高いコンテンツ分析のための神経とアストロサイト共培養アッセイ

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

生物学

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

サーモサイエンティフィックのSolaris定量PCRアッセイを用いて定量的リアルタイムPCR

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

エメラルドアッシュボーラーの遺伝子発現の解析（ Agrilus planipennis）を使用して定量的リアルタイム- PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

定量リアルタイムPCR（定量PCR）アレイを用いたプレマイクロRNAとマイクロRNAのプロファイリング

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

リグノセルロース系材料のためのハイスループット糖化アッセイ

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in 73 different countries throughout Africa, Asia, Europe, New Zealand, Oceania and the Americas1-2. Cogongrass forms rapidly-spreading, monodominant stands that displace a large variety of native plant species and in turn threaten the native animals that depend on the displaced native plant species for forage and shelter. To add to the problem, an ornamental variety [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] is widely marketed under the names of Imperata cylindrica 'Rubra', Red Baron, and Japanese blood grass (JBG). This variety is putatively sterile and noninvasive and is considered a desirable ornamental for its red-colored leaves. However, under the correct conditions, JBG can produce viable seed (Carol Holko, 2009 personal communication) and can revert to a green invasive form that is often indistinguishable from cogongrass as it takes on the distinguishing characteristics of the wild-type invasive variety4 (Figure 1). This makes identification using morphology a difficult task even for well-trained plant taxonomists. Reversion of JBG to an aggressive green phenotype is also not a rare occurrence. Using sequence comparisons of coding and variable regions in both nuclear and chloroplast DNA, we have confirmed that JBG has reverted to the green invasive within the states of Maryland, South Carolina, and Missouri. JBG has been sold and planted in just about every state in the continental U.S. where there is not an active cogongrass infestation. The extent of the revert problem in not well understood because reverted plants are undocumented and often destroyed.
Application of this molecular protocol provides a method to identify JBG reverts and can help keep these varieties from co-occurring and possibly hybridizing. Cogongrass is an obligate outcrosser and, when crossed with a different genotype, can produce viable wind-dispersed seeds that spread cogongrass over wide distances5-7. JBG has a slightly different genotype than cogongrass and may be able to form viable hybrids with cogongrass. To add to the problem, JBG is more cold and shade tolerant than cogongrass8-10, and gene flow between these two varieties is likely to generate hybrids that are more aggressive, shade tolerant, and cold hardy than wild-type cogongrass. While wild-type cogongrass currently infests over 490 million hectares worldwide, in the Southeast U.S. it infests over 500,000 hectares and is capable of occupying most of the U.S. as it rapidly spreads northward due to its broad niche and geographic potential3,7,11. The potential of a genetic crossing is a serious concern for the USDA-APHIS Federal Noxious Week Program. Currently, the USDA-APHIS prohibits JBG in states where there are major cogongrass infestations (e.g., Florida, Alabama, Mississippi). However, preventing the two varieties from combining can prove more difficult as cogongrass and JBG expand their distributions. Furthermore, the distribution of the JBG revert is currently unknown and without the ability to identify these varieties through morphology, some cogongrass infestations may be the result of JBG reverts. Unfortunately, current molecular methods of identification typically rely on AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) and DNA sequencing, both of which are time consuming and costly. Here, we present the first cost-effective and reliable PCR-based molecular genotyping method to accurately distinguish between cogongrass and JBG revert.

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

We provide a cost-effective and rapid molecular genotyping protocol that employs variety-specific PCR primers that target DNA sequence differences within the chloroplast trnL-F spacer region to differentiate between varieties of Imperata cylindrica (cogongrass) that cannot be distinguished by morphology alone. These varieties include the federally listed noxious weed, cogongrass and closely-related, wide-spread ornamental variety, I. cylindrica var. koenigii (Japanese blood grass).

の野生型と観賞用品種を区別するPCRベースのジェノタイピング法チガヤ</em

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping project is to collect a tissue sample from each individual plant. The traditional approach to this task is to sample plants one-at-a-time. If one wishes to genotype hundreds or thousands of individuals, however, using this strategy results in a significant bottleneck in the genotyping pipeline. The Ice-Cap method that we describe here provides a high-throughput solution to this challenge by allowing one scientist to collect tissue from several thousand seedlings in a single day 1,2. This level of throughput is made possible by the fact that tissue is harvested from plants 96-at-a-time, rather than one-at-a-time.
The Ice-Cap method provides an integrated platform for performing seedling growth, tissue harvest, and DNA extraction. The basis for Ice-Cap is the growth of seedlings in a stacked pair of 96-well plates. The wells of the upper plate contain plugs of agar growth media on which individual seedlings germinate. The roots grow down through the agar media, exit the upper plate through a hole, and pass into a lower plate containing water. To harvest tissue for DNA extraction, the water in the lower plate containing root tissue is rapidly frozen while the seedlings in the upper plate remain at room temperature. The upper plate is then peeled away from the lower plate, yielding one plate with 96 root tissue samples frozen in ice and one plate with 96 viable seedlings. The technique is named "Ice-Cap" because it uses ice to capture the root tissue. The 96-well plate containing the seedlings can then wrapped in foil and transferred to low temperature. This process suspends further growth of the seedlings, but does not affect their viability. Once genotype analysis has been completed, seedlings with the desired genotype can be transferred from the 96-well plate to soil for further propagation. We have demonstrated the utility of the Ice-Cap method using Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings. We expect that the method should also be applicable to other species of plants with seeds small enough to fit into the wells of 96-well plates.

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

The Ice-Cap method allows one to grow plants in 96-well plates and non-destructively harvest root tissue from each seedling. DNA extracted from this root tissue can be used for genotyping reactions. We have found that Ice-Cap works well for Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings.

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It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

高解像度メルト解析を用いたPCRを使用して、迅速かつ効率的なゼブラフィッシュ遺伝子型決定

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

ペプチドエピトープの定量分析のための高スループット、MHC II結合アッセイ

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

転写後調節される遺伝子の化学モジュレーターのためのハイスループットスクリーニング

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...