このプロトコルは、ユーザーを支援し、BMA、AEG、および2、4-DABの抽出の正しい手順を学生に教えます。これにより、エラーの可能性を最小限に抑え、一貫した結果を生成します。この方法は、サウナ細菌マトリックス中のBMAとその異性体AEGおよび2,4-DABの抽出に一般的に使用され、検証された方法です。
この方法は、BMAの毒性に関するさらなる研究に利用でき、BMAとそれに関連する健康への影響についての理解を深めることができます。シアノバクテリアサンプルを3, 500 Gで摂氏25度で10分間遠心分離することから始めます。そして、上清を生物学的廃棄物に捨てる。
ペレットが入っている遠沈管をシーリングフィルムで覆い、鋭い長いノーズピンセットを使用してフィルムにいくつかの穴を開けます。次に、チューブを摂氏マイナス80度で直立させて保管します。30分後、チューブを直立させて凍結乾燥機のガラス容器に入れ、容器をマイナス80°Cの冷凍庫に5分間入れて冷却します。
冷凍庫からガラス容器を取り出し、ゴム製の蓋を取り付けます。凍結乾燥機のゴム製バルブ出口のハンドルが上向きで、大気に通気していることを確認してください。ガラス容器をしっかりと取り付けます。
ゴム製バルブ出口のハンドルをゆっくりと回して下の位置を指し、ジャーを真空にさらします。また、最大24時間の凍結乾燥により、すべての液体を昇華させます。完了したら、15〜50ミリグラムの凍結サンプルペレットを15ミリリットルの遠沈管に計量します。
分析天びんを使用します。サンプルに、300〜600マイクロリットルの10%トリクロロ酢酸水溶液またはTCAを加えます。砕いた氷で満たされた容器にサンプルチューブを置きます。
プローブの端をサンプルに完全に浸し、スタートを押す前に、70%エタノールをスプレーした糸くずの出ない紙のワイプで超音波処理器プローブを拭きます。完了したら、遠心チューブを含むサンプルを氷上に1分間置きます。そして、細胞溶解を確実にするために超音波処理プロセスを繰り返します。
試料を摂氏4度で24時間冷却した後。摂氏8度で15分間3, 500 gで遠心分離します。次いでマイクロピペットを用いて、上清を遊離画分とラベル付けされた2ミリリットルのチューブに移す。
サンプルペレットに400マイクロリットルの10%水性TCAを加え、ボルテックス攪拌またはマイクロピペットチップでペレットを分解します。遠心分離し、上清を同じ2ミリリットルの遊離画分チューブに移します。10%TCAアセトンを使用して、この手順を3回繰り返します。
蓋を開けた状態で遊離フラクションチューブを遠心蒸発器に入れ、揮発性液体がすべて除去されるまで入れます。サンプルに揮発性液体がなくなったら、チューブを天井フィルムでしっかりと覆い、鋭い長いノーズピンセットを使用していくつかの穴でフィルムに穴を開けます。前に実証した凍結乾燥の後、サンプルを200マイクロリットルの20ミリモル塩酸で再構成し、摂氏マイナス80度の冷凍庫に入れます。
マイクロピペットを使用してサンプルペレットに400マイクロリットルの100%アセトンを加え、ボルテックス攪拌またはマイクロピペットチップを使用してペレットを分解します。洗浄および再懸濁したペレットを対応するガラスシェルバイアルに定量的に移す。1ミリリットルのマイクロピペットを使用した。
サンプルチューブにさらに400マイクロリットルのアセトンを加えて、残りのペレットを移します。遠心分離機で上清液を生物学的廃棄物にデカントしてから、遠心蒸発器でペレットを乾燥させ、液体が除去されてペレットが乾燥するまで乾燥させます。真空加水分解ファイルを準備するには、加水分解ファイルの底に1ミリリットルの6モル塩酸を加えます。
乾燥したサンプルを含むラベル付きシェルバイアルをピンセットを使用して加水分解ファイルに慎重に挿入し、直立した安定した位置を確保します。蓋を加水分解ファイルに取り付け、蓋の赤いノブを押してバルブを閉じます。真空ポンプをオンにした後、真空管を加水分解ファイルの蓋のヘッドに取り付け、蓋の緑色のノブを押してバルブを開きます。
次に、真空ポンプでバイアルから空気を1分間除去します。次に、加水分解バイアル蓋の赤いノブを押してバイアルを閉じます。真空ポンプの電源を切り、真空管を取り外します。
実験台の窒素ガス蛇口にゴムチューブを取り付けます。そして、タップを少し開きます。チューブの端に親指を置き、密封して、圧力が上昇するにつれてガスが逃げ始めるまで数えます。
次に、ゴムチューブのもう一方の端を加水分解バイアル蓋のヘッドに取り付けます。そしてすぐにふたの緑色のノブを押します。ガスが逃げるのにかかる時間を数えます。
蓋の赤いつまみをすばやく押して、ゴムチューブを取り外します。真空処理プロセス全体を2回繰り返します。ガラス加水分解バイアルに空気がなく、窒素ガスで満たされていることを確認します。
加水分解バイアルを摂氏110度に設定された予熱オーブンに16〜18時間入れます。オーブン手袋を使用して、ガラス加水分解バイアルをオーブンから取り出します。バイアルをヒュームフード内で10分間冷ましてから、緑色のノブを反対側に向けて押して圧力とガスを解放します。
加水分解したサンプルペレットを200マイクロリットルの20モル塩酸でシェルバイアルに再構成し、ペレットを再懸濁します。再構成されたサンプルペレットを含むシェルバイアルを5、300Gおよび摂氏25度で2分間遠心分離する。再構成された遊離画分サンプルとタンパク質画分を、0.2ミクロンの細孔メンブレンフィルターを含む2つのミリリットルのフィルターチューブに移し、遊離画分とタンパク質画分としてラベル付けします。
遠心分離用のチューブを5, 000 Gおよび摂氏25度で30分間置きます。色分けされた線で示されるβ-メチルアミノ-L-アラニンまたはBMAAおよびその異性体を含む標準の多重反応モニタリングクロマトグラムをここに示します。BMAA、DABおよびAEGの3つの異性体すべてについて、リデル湖から収集されたメリズモペディア種の遊離画分で陽性の検出が観察された。
一方、ワカ水道から採取されたミクロシスティスフロスアクアエ種の結合画分は、BMAAとその異性体について否定的な結果を示しました。再懸濁されたペレットは、シアノバクテリアの質量に基づいて正確な正規化ポイントを可能にするために、対応するシェルバイアルに定量的に移す必要があります。このステップを実行する際には、患者とデューデリジェンスをお勧めします。
次の手順に従います。抽出された画分は、逆相を可能にするために失活ステップを経なければならない。液体クロマトグラフィー、タンデム質量分析。
この技術の応用は、さまざまな科学分野を拡大します。環境サンプル中のカニクイザルの分析による環境科学を含みます。BMAの誤化理論の調査を通じて毒物学や生化学などの分野。
