Este protocolo ajudará os usuários e ensinará aos alunos as etapas corretas na extração de BMA, AEG e 2, 4-DAB. Minimizando assim as chances de erro e produzindo resultados consistentes. Este método é um método comumente utilizado e validado para a extração de BMA e seus isômeros, AEG e 2, 4-DAB em uma matriz bacteriana de sauna.
Este método pode ser utilizado para aprofundar a pesquisa sobre a toxicidade dos BMAs e fornecer uma maior compreensão sobre o BMA e seus efeitos associados à saúde. Comece por centrifusão a amostra de cianobactérias a 3.500 G por 10 minutos a 25 graus Celsius. E descartar o sobrenadante em resíduos biológicos.
Cubra o tubo de centrífuga que contém o pellet com uma película de vedação e perfure alguns orifícios no filme usando um pinçador de nariz longo afiado. Em seguida, armazene o tubo ereto a menos 80 graus Celsius. Após 30 minutos, coloque o tubo na posição vertical em um recipiente de vidro liofilizador e coloque o recipiente dentro do congelador de menos 80 graus Celsius por cinco minutos para resfriamento.
Retire o recipiente de vidro do congelador e prenda a tampa de borracha. Certifique-se de que a alça na saída da válvula de borracha do liofilizador está apontando para cima e ventilada para a atmosfera. Prenda o recipiente de vidro com firmeza.
Gire lentamente a alça da saída da válvula de borracha para apontá-la em uma posição para baixo para expor o frasco ao vácuo. E aguarde até 24 horas de liofilização para sublimar todo o líquido. Quando terminar, pese de 15 a 50 miligramas de pellets de amostra congelados em um tubo de centrífuga de 15 mililitros.
Usando uma balança analítica. À amostra, adicionar 300 a 600 microlitros de ácido tricloroacético aquoso a 10% ou TCA. Coloque os tubos de amostra em um recipiente cheio de gelo triturado.
Limpe a sonda do sonicator com um lenço de papel sem fiapos pulverizado com etanol a 70% antes de imergir totalmente a extremidade da sonda na amostra e pressionar o início. Uma vez feito, coloque a amostra contendo o tubo de centrífuga no gelo por um minuto. E repita o processo de sonicação para garantir a lise celular.
Após arrefecimento da amostra a quatro graus Celsius durante 24 horas. Centrífuga a 3.500 G por 15 minutos a oito graus Celsius. Em seguida, usando uma micropipeta, transfira o sobrenadante para um tubo de dois mililitros rotulado como fração livre.
Adicione 400 microlitros de TCA 10% aquoso ao pellet da amostra e quebre o pellet por agitação de vórtice ou com a ponta da micropipeta. Centrifugar e transferir o sobrenadante para o mesmo tubo de fração livre de dois mililitros. Repita este passo uma terceira vez usando acetona 10%TCA.
Coloque o tubo de fração livre com a tampa aberta em um evaporador centrífugo até que todo o líquido volátil seja removido. Uma vez que a amostra esteja livre de líquidos voláteis, cubra o tubo com segurança com o filme do teto e perfure o filme com alguns orifícios usando um pinçador de nariz longo afiado. Após liofilização demonstrada anteriormente, reconstituir a amostra com 200 microlitros de ácido clorídrico 20 milimolares e colocá-la num congelador de menos 80 graus Celsius.
Adicione 400 microlitros de acetona a 100% no pellet da amostra usando uma micropipeta e quebre o pellet usando a agitação do vórtice ou a ponta da micropipeta. Transfira quantitativamente o pellet lavado e ressuspenso para o frasco para injetáveis de casca de vidro correspondente. Usando uma micropipeta de um mililitro.
Adicione mais 400 microlitros de acetona ao tubo de amostra para ajudar a transferir o pellet restante. Centrifugar e decantar o líquido sobrenadante em resíduos biológicos antes de secar o pellet em um evaporador centrífugo até que o líquido seja removido e o pellet esteja seco. Para preparar o arquivo de hidrólise a vácuo, adicione um mililitro de ácido clorídrico de seis molares ao fundo do arquivo de hidrólise.
Insira cuidadosamente os frascos para injetáveis com casca rotulados com amostras secas no ficheiro de hidrólise utilizando uma pinça que assegure uma posição estável na posição vertical. Fixe a tampa ao arquivo de hidrólise e empurre o botão vermelho na tampa para fechar a válvula. Depois de ligar a bomba de vácuo, prenda o tubo de vácuo à cabeça da tampa do arquivo de hidrólise e pressione o botão verde na tampa para abrir a válvula.
Em seguida, deixe a bomba de vácuo remover o ar do frasco para injetáveis durante um minuto. Em seguida, feche o frasco para injetáveis pressionando o botão vermelho na tampa do frasco para injetáveis de hidrólise. Desligue a bomba de vácuo e remova o tubo de vácuo.
Fixe um tubo de borracha à torneira de gás nitrogênio na bancada do laboratório. E abra a torneira ligeiramente. Coloque o polegar no final do tubo, sele-o e conte até que o gás comece a escapar à medida que a pressão se acumula.
Em seguida, prenda a outra extremidade do tubo de borracha à cabeça da tampa do frasco para injetáveis de hidrólise. E empurre imediatamente o botão verde da tampa. Conte o tempo necessário para o gás escapar.
Empurre rapidamente o botão vermelho na tampa e remova o tubo de borracha. Repita todo o processo de tratamento a vácuo duas vezes. Garantir que o frasco para injetáveis de hidrólise de vidro está livre de ar e cheio de gás azoto.
Coloque o frasco para injetáveis de hidrólise num forno pré-aquecido regulado a 110 graus Celsius durante 16 a 18 horas. Usando luvas de forno, remova o frasco de hidrólise de vidro do forno. Deixe o frasco para injetáveis arrefecer no interior do exaustor durante 10 minutos antes de empurrar o botão verde enquanto o afasta para libertar a pressão e o gás.
Reconstituir os pellets de amostra hidrolisados com 200 microlitros de ácido clorídrico de 20 molares no frasco para injetáveis com casca e ressuspender o pellet. Centrifugar os frascos para injetáveis contendo os pellets de amostra reconstituídos durante dois minutos a 5, 300 G e 25 graus Celsius. Transfira as amostras de fração livre reconstituída e a fração proteica para os tubos filtrantes de dois mililitros contendo filtros de membrana de poros de 0,2 mícron e rotulados como fração livre e fração proteica.
Coloque os tubos para centrifugação por 30 minutos a 5.000 G e 25 graus Celsius. O cromatograma de monitoramento de reações múltiplas de um padrão contendo beta-metilamino-L-alanina ou BMAA e seus isômeros indicados pelas linhas codificadas por cores é mostrado aqui. Uma detecção positiva para os três isômeros, BMAA, DAB e AEG foi observada na fração livre das espécies de Merismopedia coletadas do Lago Liddel.
Considerando que a fração ligada das espécies Microcystis flos-aquae coletadas da Waka Waterworks ilustrou um resultado negativo para o BMAA e seus isômeros. O pellet ressuspenso deve ser quantitativamente transferido para o frasco para injetáveis de concha correspondente para permitir um ponto preciso de normalização com base na massa de cianobactérias. Os pacientes e a devida diligência são aconselhados durante a execução desta etapa.
Seguindo este procedimento. As frações extraídas terão que passar por uma etapa de desvitalização para permitir a fase reversa. Cromatografia líquida, análise por espectrometria de massas em tandem.
A aplicação desta técnica expande vários campos científicos. Incluindo as ciências ambientais através da análise de cinotoxinas em amostras ambientais. E campos como toxicologia e bioquímica através da investigação da teoria da Misincorporação do BMA.
