Этот протокол поможет пользователям и научит студентов правильным шагам в извлечении BMA, AEG и 2, 4-DAB. Тем самым сводя к минимуму вероятность ошибки и получая последовательные результаты. Этот метод является широко используемым и проверенным методом экстракции BMA и его изомеров, AEG и 2, 4-DAB в бактериальной матрице сауны.
Этот метод может быть использован для дальнейших исследований токсичности BMA и обеспечения лучшего понимания BMA и связанных с ним последствий для здоровья. Начните с центрифузии образца цианобактерий с 3 500 г в течение 10 минут при 25 градусах Цельсия. И выбрасывание супернатанта в биологические отходы.
Накройте трубку центрифуги, содержащую гранулу, уплотнительной пленкой и проткните несколько отверстий в пленке с помощью острого длинного носового пинцета. Затем храните трубку в вертикальном положении при минус 80 градусах Цельсия. Через 30 минут поместите трубку вертикально в стеклянный контейнер сублимационной сушилки и поместите контейнер в морозильную камеру при температуре минус 80 градусов Цельсия на пять минут для охлаждения.
Извлеките стеклянную емкость из морозильной камеры и прикрепите резиновую крышку. Убедитесь, что ручка на выходе резинового клапана сублимационной сушилки направлена вверх и вышла в атмосферу. Плотно прикрепите стеклянную емкость.
Медленно поверните ручку выходного отверстия резинового клапана, чтобы направить его в положение вниз, чтобы подвергнуть банку воздействию вакуума. И дайте до 24 часов сублимационной сушки, чтобы сублимировать всю жидкость. Когда это будет сделано, взвесьте от 15 до 50 миллиграммов замороженных гранул образца в 15-миллилитровую центрифужную трубку.
Использование аналитического баланса. К образцу добавляют от 300 до 600 микролитров 10% водной трихлоруксусной кислоты или ТЦА. Поместите пробоотборники в контейнер, наполненный измельченным льдом.
Протрите зонд ультразвуковика безворсовой бумажной салфеткой, распыленной 70% этанолом, прежде чем полностью погрузить конец зонда в образец и нажать на начало. После этого поместите образец, содержащий трубку центрифуги, на лед на одну минуту. И повторите процесс обработки ультразвуком, чтобы обеспечить лизис клеток.
После охлаждения образца при четырех градусах Цельсия в течение 24 часов. Центрифуга при 3, 500 G в течение 15 минут при восьми градусах Цельсия. Затем, используя микропипетку, переведите супернатант в двухмиллилитровую трубку, помеченную свободной фракцией.
Добавьте 400 микролитров 10% водного ТЦА в гранулу образца и разбейте гранулу либо вихревым перемешиванием, либо наконечником микропипетки. Центрифугируйте и перенесите супернатант в ту же двухмиллилитровую трубку свободной фракции. Повторите этот шаг в третий раз, используя 10%TCA ацетон.
Поместите трубку со свободной фракцией с открытой крышкой в центробежный испаритель до тех пор, пока вся летучая жидкость не будет удалена. Как только образец освободится от летучих жидкостей, надежно накройте трубку потолочной пленкой и проткните пленку несколькими отверстиями, используя острый длинный носовой пинцет. После сублимационной сушки, продемонстрированной ранее, восстановите образец с 200 микролитрами 20-миллиметровой соляной кислоты и поместите его в морозильную камеру с температурой минус 80 градусов цельсия.
Добавьте 400 микролитров 100% ацетона на гранулу образца с помощью микропипетки и разбейте гранулу с помощью либо вихревого перемешивания, либо наконечника микропипетки. Количественно переложить промытую и повторно суспендированную гранулу в соответствующий стеклянный флакон оболочки. Используя одну миллилитровую микропипетку.
Добавьте еще 400 микролитров ацетона в пробирку, чтобы помочь перенести оставшуюся гранулу. Центрифугируйте и декантируйте жидкость супернатанта в биологические отходы перед сушкой гранулы в центробежном испарителе до тех пор, пока жидкость не будет удалена и гранула не высохнет. Для приготовления вакуумного гидролизного файла добавляют один миллилитр шести молярных соляных кислот на дно файла гидролиза.
Аккуратно вставьте меченые флаконы с высушенными образцами в гидролизный файл с помощью пинцета, обеспечивающего вертикальное устойчивое положение. Прикрепите крышку к файлу гидролиза и нажмите красную ручку на крышке, чтобы закрыть клапан. После включения вакуумного насоса прикрепите вакуумную трубку к головке крышки гидролизного файла и нажмите зеленую ручку на крышке, чтобы открыть клапан.
Затем позвольте вакуумному насосу удалить воздух из флакона в течение одной минуты. Затем закройте флакон, нажав красной ручкой на крышку флакона для гидролиза. Выключите вакуумный насос и снимите вакуумную трубку.
Прикрепите резиновую трубку к крану газообразного азота на лабораторном стенде. И слегка откройте кран. Поместите большой палец на конец трубки, запечатайте его и считайте, пока газ не начнет выходить по мере повышения давления.
Затем прикрепите другой конец резиновой трубки к головке крышки флакона для гидролиза. И сразу же нажмите зеленую ручку крышки. Подсчитайте время, необходимое для выхода газа.
Быстро нажмите красную ручку на крышку и снимите резиновую трубку. Повторите весь процесс вакуумной обработки дважды. Обеспечение того, чтобы флакон для гидролиза стекла был свободен от воздуха и заполнен газообразным азотом.
Поместите флакон с гидролизом в предварительно нагретую духовку, установленную при температуре 110 градусов Цельсия, на 16-18 часов. С помощью перчаток для духовки извлеките флакон с гидролизом стекла из духовки. Дайте флакону остыть внутри вытяжного шкафа в течение 10 минут, прежде чем толкать зеленую ручку, отклоняясь от нее, чтобы выпустить давление и газ.
Восстановите гидролизованные гранулы образца с 200 микролитрами 20 молярной соляной кислоты во флакон оболочки и повторно суспендируйте гранулу. Центрифугируйте оболочку флаконов, содержащих восстановленный образец гранул, в течение двух минут при 5, 300 г и 25 градусах Цельсия. Перенесите восстановленные образцы свободной фракции и белковой фракции в две миллилитровые фильтрующие трубки, содержащие мембранные фильтры длиной 0,2 микрона и помеченные как свободная фракция и белковая фракция.
Поместите трубки для центрифугирования на 30 минут при 5 000 G и 25 градусах Цельсия. Здесь показана множественная хроматограмма мониторинга реакций стандарта, содержащего бета-метиламино-L-аланин или BMAA и его изомеры, обозначенные цветовыми кодированными линиями. Положительное обнаружение всех трех изомеров, BMAA, DAB и AEG наблюдалось в свободной части видов Merismopedia, собранных из озера Лиддел.
Принимая во внимание, что связанная фракция видов Microcystis flos-aquae, собранная с гидротехнического сооружения Вака, проиллюстрировала отрицательный результат для BMAA и его изомеров. Повторно суспендированная гранула должна быть количественно перенесена в соответствующий флакон оболочки, чтобы обеспечить точную точку нормализации на основе массы цианобактерий. Пациенты и должная осмотрительность рекомендуются при выполнении этого шага.
Следуйте этой процедуре. Извлеченные фракции должны будут пройти стадию девитализации, чтобы обеспечить обратную фазу. Жидкостная хроматография, тандемный масс-спектрометрический анализ.
Применение данной методики расширяет различные научные области. В том числе науки об окружающей среде через анализ цинотоксинов в образцах окружающей среды. И такие области, как токсикология и биохимия через исследование теории Misincorporation BMA.
