PIB-MSは、内因性リンプロテインホスファターゼを濃縮するために使用される新しい技術であり、それらは細胞および組織からのタンパク質と相互作用している。これは、質量分析ベースのプロテオミクスを用いたこれらのタンパク質の同定および定量を含む。この技術は、タンパク質活性または局在化を変化させる可能性のあるリンタンパク質ホスファターゼのタグ付きバージョンの外因性発現を必要としない。
また、非特異的であるか、または特定のアイソフォームを区別できない可能性のある抗体は使用しません。PPPMを調査するためのこの方法は、細胞から臨床サンプルまで、あらゆるもので使用するためにスケーリングすることができる。開始するために、室温で2分間277回gで遠心分離することによって細胞ペレットを集める。
培地を除去し、5ミリリットルのPBSで細胞を洗浄する。テキストプロトコルに記載されているように溶解バッファーを準備し、氷の上にとどまります。1ミリリットルのチルド溶解バッファーをサンプルに加え、超音波処理によってサンプルを均質化し、パルス間で細胞を氷上に保ちます。
ライセートを新鮮な1.5ミリリットルのチューブに移します。超音波処理したサンプルを21、130回gで4°Cで15分間遠心分離する。溶解物のアリコートを使用して、ビシンコニン酸アッセイを用いて総タンパク質濃度を定量する。
このステップは、各サンプル中のタンパク質濃度が等しいことを保証するために不可欠です。リンプロテインホスファターゼ阻害剤対照の場合、各サンプルについて等しいタンパク質濃度の2つのアリコートを調製する。溶解バッファーを使用して、各チューブのタンパク質濃度が等しくなるようにサンプルを希釈することができます。
1つのアリコートに1マイクロモルの遊離ミクロシスチン-LRを加え、他方に等量のDMSOを加える。サンプルをボルテックスし、氷上で15分間インキュベートします。ホスファターゼ阻害剤ビーズの調製は、試料調製の項で説明したインキュベーションステップの前または最中に実施されるべきである。
1ミリグラムのタンパク質に対して10マイクロリットルの固体ホスファターゼ阻害剤ビーズ(PIB樹脂)を使用し、1.5ミリリットルのチューブに加えます。ボルテックス処理により0.5ミリリットルの溶解バッファーでPIBを3回洗浄し、続いて室温で30秒間376回gで遠心分離した。洗浄したPIBに適量の溶解バッファーを加え、50容量%のPIBバッファー溶液を作ります。
ピペットチップとスラリーを静かにピペッティングして混合し、PIBを再懸濁します。20マイクロリットルのスラリーを、0.5ミリリットルの溶解緩衝液を含む1.5ミリリットルのチューブに移す。チューブを376回gで30秒間回転させる。
各チューブには、同量のPIBが含まれています。各チューブに固形樹脂と最大50マイクロリットルの溶解バッファーのみを残しながら上清を捨てる。溶解物をPIBを含む適切に標識されたチューブに移す。
溶解液をPIBと共に摂氏4度で1時間インキュベートし、8rpmで回転させる。溶解液とのインキュベーション後、PIBを摂氏4度で30秒間、376倍gで遠心分離し、上清を除去する。0.5ミリリットルの溶解バッファーを加えてビーズを洗浄し、チューブを反転させます 遠心分離でビーズを集め、上清を除去します。
この手順を繰り返して、合計 3 回の洗浄を行います。最終洗浄後、PIBをピペッティングせずに溶解バッファーをできるだけ除去します。2%SDSを含む溶出バッファーを調製し、溶出バッファーをPIBの4~5倍容量で添加します。
摂氏65度で1時間インキュベートし、ビーズからリンタンパク質ホスファターゼを溶出させる。チューブを室温で30秒間、376倍gで遠心分離する。溶出液を別のチューブに集め、質量分析分析またはウェスタンブロッティングに進みます。
PIBを再生するには、2%SDS溶液中で、8rpmで回転させて室温で1時間インキュベートします。ビーズを25ミリモルのTris-HCl pH 7.5で3〜5回洗浄し、洗浄あたり30分間回転させる。PIBをアジ化ナトリウムと共に25ミリモルのトリスHCL pH 7.5に貯蔵する。
質量分析分析の場合、データのフィルタリングおよび分析の方法はさまざまで、研究者または中核施設によって実行され得る。種固有のプロテオーム データベースに対して生データを検索した後、検索結果をフィルター処理し、Microsoft Excel ワークシートとしてエクスポートします。データを 3 つずつ分析します。
ラベルのない定量化のために、MS1ピーク面積測定を使用してデータを定量化します。PPPサブユニットおよびそれらのインターアクターde novoを同定するために、ミクロシスチン-LR阻害およびDMSO処理サンプルの生物学的三連を比較する。3 つの DMSO 対照処理サンプルのうち少なくとも 2 つにおいて、合計ペプチド数が 1 を超えるタンパク質のみが存在するようにデータをフィルタリングします。
樹脂に非特異的に結合するタンパク質を除外するには、ミクロシスチン-LR処理条件における総ペプチド数がPPP触媒サブユニットの総ペプチド数よりも多いタンパク質を除去する。ケラチン、コラーゲン、リボソームタンパク質、不均一な核リボヌクレオタンパク質などの一般的な汚染物質を分析から除外します。CSVファイルは、ペルセウスにデータをインポートするために不可欠です。
フィルター処理されたデータを Perseus にインポートするには、[読み込み] セクションの [汎用マトリックスのアップロード] をクリックします。基本変換に移動し、データを選択し、変換関数を x の対数ベース 2 として指定して、データを変換します。正規分布から欠損値を求めるには、[代入]、[正規分布の欠損値を置き換える]に移動し、データを選択し、計算の幅とシフトを下げます。
分位点正規化を実行するには、[正規化]、[分位点正規化] の順に移動します。アノット行、カテゴリ注釈行に移動してデータに注釈を付けます。テスト、2サンプル検定に移動し、グループ、実行する検定、および切り捨てに使用する多重仮説検定修正の方法を選択して、学生のT検定を実行します。
この関数は、対数 2 比も計算します。リンタンパク質ホスホテートおよびそのインターアクターを、PIBプルダウン実験を用いてHeLa細胞において同定し、続いてDMSO処理およびミクロシスチン-LR処理サンプル中のタンパク質存在量の標識フリー定量を行った。質量分析の火山プロットでは、特定のPIBバインダーが赤、触媒サブユニットが青、新しい候補PPPサブユニット、または相互作用タンパク質が白で示されました。
非特異的結合剤は灰色で示した。DMSO処理HeLa細胞溶解物からのlog2領域の散布図は、存在量が高度に相関していることを示し、データの再現性を示した。すべてのリンタンパク質ホスファターゼサブユニットおよび相互作用タンパク質のネットワーク解析は、これらのタンパク質がPIBプルダウンにおける特異的相互作用因子であることを示した。
グローバルプロテオミクス解析を実施し、その結果をPIB解析と比較して、PPPome組成がPPPの存在量によって駆動されるのか、翻訳後メカニズムによって調節されているのかを判断することができます。PIB-MSは広く適用可能なツールであり、同相間サンプルと有糸分裂サンプルの違い、がん細胞株間の差異など、さまざまな条件下でのPPP発現パターンの違いを特定することができました。
