Name: oligopeptide competition assay for phosphorylation site determination
Uploaded: 2017-05-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination at JoVE.com

この研究は、韓国政府の資金援助を受けた韓国国立研究財団（MSIP）（No. 2015R1A2A1A10052663およびNo. 2014M1A3A3A02034698）の支援を受けて行われました。

1.安全性注意：このプロトコールでは、[γ- 32 P] -ATPを用いてAMPKの活性を評価しています。リン-32は放射性同位元素であり、主にβ線を放出する。ベータ粒子のサイズは非常に小さいので、衣類や肌に容易に浸透することができます。ベータ線への外部および内部の両方の暴露は、皮膚の火傷および組織の損傷を引き起こすことを含め、人の健康に有害な可能性があります。 <ol><li>アクリル遮蔽などの適切な保護を使用して[γ- 32 P] -ATPの使用を必要とするすべてのステップを実行します。 </li><li>すべての人員に、すべての手技中に有害な放射線への暴露の程度を監視するために、電子式個人線量計（EPD）が装備されていることを確認する。 </li><li>適切な訓練と規制当局の承認後にのみ、オープンソースの放射線を取り扱うこと。 注：ここでは、すべての実験は、ソウル国立大学でのオープンソース放射線使用の訓練の終了後に行われた韓国政府（nssc.go.kr/nssc/en）の承認を得た。 </li><li>地域の規制に従って放射性廃棄物を処分する。 注：ここでは、ソウル国立大学環境保護安全研究所の指示に従った。以下は、米国および欧州諸国の規制当局のリストである：米国、米国原子力規制委員会（http://www.nrc.gov/）。英国、健康安全局（HSE）（http://www.hse.gov.uk）;フランス、Autoritédesûreténucléaire（https://www.asn.fr/）;ドイツ、連邦環境省、自然環境保全、建築・原子力安全局（BMU）（http://www.bmu.de）などがあります。 </li></ol> 2. インビトロ競合キナーゼアッセイ<ol><li> 競合ペプチドの構築 <ol><li> AMPKによってリン酸化されたコンセンサスモチーフを決定する。 注：AMPKはコンセンサスモチーフを認識し、＃934; - [X、β] -XX-Ser / Thr-XXX-Φ。コンセンサス配列において、Φは疎水性アミノ酸（バリン[V]、ロイシン[L]、メチオニン[M]およびイソロイシン[I]）を表し、βは塩基性アミノ酸（ すなわちリシン[K]、アルギニン[ R]、およびヒスチジン[H]） 1 。 </li><li>上記コンセンサスモチーフに従って、標的配列からセリンまたはスレオニン残基を選択する。ヒトNrf2の3つの推定部位を使用する（Ser153を含む＃1、148-157; Ser335を含む＃2、330-339;およびSer558を含む＃3,553~562）。 </li><li>推定上の部位を模倣する10残基のペプチドを商業的に合成する。合成した生成物を、各ペプチドについて98％以上の純度を有する凍結乾燥粉末として得る。 </li><li>キナーゼ緩衝液を用いてペプチドを溶解し、71.667g / Lの濃度にする。ペプチドがキナーゼ緩衝液に溶解しない場合は、それを20％DMSOに溶解する。それが不溶性のままであるならば、putを模倣するペプチド溶解性を高めるために延長することができる。 </li></ol></li></ol><ol start="2"><li> インビトロ競合AMPKキナーゼアッセイ <ol><li>以下のように5×キナーゼ緩衝液を調製する：100mM HEPES、pH7.4; 25mM MgCl 2 ; 5mM EGTA; 5mM DTT; 125mMβ-グリセロリン酸（セリン/トレオニンホスファターゼ阻害剤）; 5mM Na 3 VO 4 （チロシンホスファターゼ阻害剤）。 0.5％（v / v）プロテアーゼ阻害剤カクテルセットIII、1mM冷ATP;および500μMAMP。 注：AMPは、AMPK活性を試験するためのキナーゼ緩衝液の必須成分である。この緩衝液は、セリン/スレオニンキナーゼおよびチロシンキナーゼの両方の活性を測定するために使用することができる。 </li><li>以下の組換えタンパク質および合成ペプチドを氷上で解凍する：AMPK; Nrf2;オリゴペプチド＃1、＃2、および＃3を含む。 </li><li>氷上で0.15μgのAMPK、0.4μgのNrf2（〜4pmol）、0.43mgのオリゴペプチド（約300nmol）、および6μLの5×キナーゼ緩衝液の反応緩衝液を調製する。 A滅菌蒸留水（DW）で最終容量を30μLに調整する。 注：反応緩衝液を調製した後の[γ- 32 P] -ATPの添加は、キナーゼ自己リン酸化による放射性シグナルを減少させる可能性がある。 </li></ol></li><li> 反応物質の運転 注記：以下のすべてのプロセスは、アクリルシールド、ラックまたはブロック、および適切な個人用保護具を使用して保護下で行う必要があります。 <ol><li>実験開始前に加熱ブロックを30°Cに設定してください。 </li><li>氷上で[γ- 32 P] -ATP（1μCi）1μLを反応チューブに加えます。ピペッティングにより反応バッファーを数回上下に混合する。 注： 32 Pの放射能は、約14日間の短い半減期を有する。半減期を考慮して（ 例えば、 [γ- 32 P] -ATPの産生から1ヶ月後、[γ- 32 P] -ATPの4μLを添加して）-ATPを1μCiとする）。 </li><li>試料を30℃の加熱ブロックに15〜30分間インキュベートする。この工程中、7.5％ドデシル硫酸ナトリウム - ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）ゲルを調製する。標的タンパク質のサイズに応じてゲルのパーセンテージを調整する。 </li><li> 10％SDSサンプル緩衝液（10％（v / v）グリセロール、20％（w / v）SDS、15.42％（w / v）ジチオスレイトール、90％（v / v）0.5 Mトリス-HCl（pH6.8）、および0.02％（w / v）ブロモフェノールブルー）を添加した。ピペッティングにより反応バッファーを数回上下に混合する。 </li><li>サンプルを7.5％SDS-PAGEゲルで70Vで20分間、140Vで1時間連続して試験する。 注記：ゲルの最後のブロモフェノールブルーラインには、非常に高い放射性シグナルが含まれています。バックグラウンドシグナルを減らすために次のステップに進む前に、青色の線より下のゲルを取り除くことをお勧めします。 </li><li> SDS-PAGE後、キャスターからゲルを静かに取り出します。ゲルをガラスに入れる次のステップのためにube。 </li><li>固定緩衝液でゲルを20分間固定する（50％メタノールおよび10％氷酢酸）。 </li><li>静かにゲルを濾紙上に移し、透明なラッパーで覆う。ゲルがこの段階で容易に引き裂かれることがあることに注意してください。真空ゲル乾燥機でゲルを80℃で1時間乾燥する。 </li></ol></li><li> 視覚化 <ol><li>燐光体スクリーンまたはX線フィルムのいずれかにゲルを一晩（通常約16時間）さらす。 注：蛍光体スクリーンは、超明るい光にさらされた後に再使用することができます。 X線フィルムを使用する場合は、ゲルを2日間暴露してください。 X線フィルムは、蛍光体スクリーンよりも感度が低い。 </li><li>蛍光体イメージャで蛍光体スクリーンをスキャンします。画像を高解像度のTIFFまたはビットマップファイルとして書き出します。 </li><li>視覚化した後、クーマシーブリリアントブルー（CBB）染色用ガラスまたはプラスチック容器にゲルを移す。 </li><li> DWでゲルを洗う。 DWを破棄して汚れゲルを染色試薬で1時間インキュベートする。 </li><li>試薬を捨て、DWでゲルを1時間または一晩脱染色する。透明なプラスチックフィルム（またはそれに相当するもの）の間にゲルを置き、オフィススキャナーでスキャンします。 </li></ol></li></ol> 3.部位特異的突然変異体を用いるインビトロキナーゼアッセイ<ol><li> pGEX-Nrf2の部位特異的突然変異誘発 <ol><li>変異原プライマー設計 注：突然変異誘発プライマーの設計は突然変異誘発の成果にとって重要です。以下は、突然変異誘発プライマーの設計のためのいくつかの考慮事項です。プライマーの中央に所望の変異を有する25〜45塩基からなるプライマーを作製する。プライマーは40〜60％のGC含量を有し、1つ以上のGまたはC塩基で終結する必要があります。プライマーのT mが、式[T m = 81.5 + 0.41（％GC） - （675 /塩基長） - ％ミスマッチ]に従って78℃以上であることを確認する。 注：その純度は変異効率にとって重要であるからである。変異原性プライマーを設計するためのいくつかのウェブサイトがあります。 <ol><li> 「部位特異的突然変異誘発のためのプライマーの設計」（http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp）のプライマー設計プログラムを開きます。 </li><li>ヒトNrf2 DNA配列（Access No. NM_006164.4）を貼り付け、「翻訳したものをアップロードする」ボタンを選択します。 </li><li>アラニンに変換される翻訳されたアミノ酸配列からセリン558残基を選択する。突然変異誘発プライマーを使用して、アラニンの代わりにagcからgccへのセリンのコドンを置換する。 </li><li>プライマーの長さ、T mおよびGC含量を考慮する。 注：突然変異誘発プライマーは最終的に5&#39;-ctactgaaaaaaaaaacccccttatatctcgaag-3 &#39;として設計されています。 </li></ol></li><li>ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いた変異鎖合成のための反応<ol><li> PCR反応混合物を氷上で調製する：10×反応緩衝液、50ngのpGEX-GST-Nrf2,125ngのフォワードプライマー、125ngのリバースプライマー、1μLのdNTP混合物（各10mM）、2.5UのPfu DNAポリメラーゼ、および滅菌DWを50μLに添加した。 </li><li>以下のサイクリングプログラムを用いてpGEX-GST-Nrf2変異体鎖合成のためのPCRを行う：95℃で30秒間1サイクル; 95℃で30秒間、55℃で1分間、および68℃で90秒間の18サイクル; 68℃で5分間、1サイクル。 注：プラスミドの長さによっては、サイクリングパラメータが変更されることがあります。 </li><li>氷上に2分間置いて次の工程のために反応物を冷却する。あるいは、4℃で一晩保存してください。 </li></ol></li><li> Dpn I消化および突然変異プラスミドの選択<ol><li>冷却後、各反応物にDpn I制限酵素（10U /μL）1μLを添加する。ピペットでよく穏やかに混合し、1分間遠心分離する。 </li><li> 37℃で2時間インキュベートして、親pGEX-GST-Nrf2二本鎖DNAを消化し、一本鎖DNA。 </li><li> DH5αスーパーコンピテント細胞を氷上で静かに解凍する。 </li><li>あらかじめ冷却したDH5αスーパーコンピテント細胞150μLに50μLの反応物を添加し、少なくとも30分間氷上でインキュベートする。 </li><li> 42℃に予熱した加熱ブロックにチューブを移し、90秒間放置する。 2分間氷上に置く。 </li><li> 形質転換されたDH5α細胞に予熱した溶菌液（LB）を添加し、180rpmで振盪しながら37℃で1時間インキュベートする。 </li><li>形質転換された細胞をLB-アンピシリン寒天プレート上に広げ、37℃で一晩インキュベートする。 注：プラスミドGEX-GST-Nrf2はアンピシリン耐性マーカーを有するため、アンピシリンを選択に使用する。突然変異誘発されたプラスミドの耐性マーカーに応じて、適切な抗生物質を使用してください。 </li><li>プレートから単一のコロニーを選択し、5mLのLB-アンピシリンに移し、180rpmで振盪しながら37℃で一晩インキュベートする。突然変異誘発配列の確認のために、少なくとも3つのコロニーを評価する。 </li><li> DNA配列分析のためにDNAミニプレップキットを用いてDNAを抽出する;製造元のプロトコルに従ってください。 </li><li>製造者のプロトコールに従って自動DNA配列分析器を用いて突然変異誘発DNA配列を確認する。変異体配列の確認のために少なくとも200 ngのDNA構築物を使用する。 </li></ol></li></ol></li><li> 組換えGST-Nrf2タンパク質の精製 <ol><li>大腸菌における突然変異誘発性GST-Nrf2融合タンパク質の発現 <ol><li>突然変異誘発性pGEX-GST-Nrf2プラスミドをBL21細胞に形質転換する。アンピシリン（100μg/ mL）を含む25 mLのLBブロスに1つのコロニーを接種し、37℃で一晩回転器でインキュベートする。 </li><li>培養した細胞を、100：100の希釈比でアンピシリン（100μg/ mL）を含有する100mLのLBブロスに接種する。 </li><li> 37℃でインキュベートする。または600nmでの吸光度が約0.4〜0.8（約4時間）に達するまで繰り返す。 </li><li> 100μLの1M IPTGを100mLの培養細胞に添加して、1mM IPTGの最終濃度を調製する。 </li><li>タンパク質を発現させるために、回転子上で30℃で6時間または一晩細胞をインキュベートする。 </li><li>細胞を5,000 xgで20分間遠心分離し、1mLの細菌溶解緩衝液（25mM HEPES、5mM EDTA、2mM DTT、0.1％CHAPS、1μg/ mLペプスタチン、0.5μg/ mLロイペプチン、および1mMのPMSF）を氷上でインキュベートした。 </li><li>最大パワー出力の50％で2分間、2秒間隔で超音波ホモジナイザーを用いて細胞ペレットを溶解する。 </li><li> 12,000×gで15分間4℃で細胞を遠心分離し、上清を集める。 </li></ol></li><li>組換えGST-Nrf2タンパク質の精製<ol><li> 200μLの50％（v / v）グルタチオン - アガロースビーズを調製し、1mLのPBS（pH 7.3; 140mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na 2 </sub&gt; HPO 4 、および1.8mM KH 2 PO 4 ）。 500×gで1分間遠心分離してビーズを集める。洗濯を3回繰り返します。 </li><li> 50％（v / v）グルタチオンアガロースビーズ200μLに細胞溶解物を加え、4℃で2時間インキュベートする。 </li><li> 500 xgで1分間遠心分離してGST-Nrf2タンパク質と結合したグルタチオン - アガロースビーズを回収する。 31G針を備えた1mLシリンジを用いて上清を除去する。 </li><li>ステップ1のようにビーズを1 mLのPBS（pH 7.3）で洗浄します。 </li><li> GST-Nrf2と組み合わせたグルタチオン - アガロースビーズに500μLの溶出バッファー（50mM Tris-HClおよび10mM還元グルタチオン、pH 8.0）を添加する。エンドオーバーエンド回転子で4℃、30分間インキュベートする。 </li><li> 500xgで1分間遠心分離し、上清を集める。 </li><li>再度300μLの溶出緩衝液をビーズに加え、3.2.2.5-3.2.2.6の工程を2回繰り返す。 </li></ol></li><li>精製されたGST-Nrf2タンパク質の確認<ol><li> 0.5μgの標準タンパク質BSAでタンパク質量を視覚化するためにサンプル5μLを調製する。 </li><li>サンプルを7.5％SDS-PAGEゲルで70Vで20分間、次いで140Vで60分間実行する。 </li><li> 0.1％CBB染色溶液（0.1gのCBB R250,40mLの99％メタノール、10mLの氷酢酸、50mLの蒸留H 2 O）で2時間染色し、脱色した（メタノール30mL、 10mLの氷酢酸、および60mLの蒸留水）で、バンドがはっきりと示されるまで撹拌する。 </li><li>消化したゲルを濾紙に置き、透明なラッパーで覆う。真空ゲル乾燥機でゲルを80℃で1時間乾燥する。 </li><li> インビトロ AMPKキナーゼアッセイのためのデンシトメトリーによる突然変異体GST-Nrf2タンパク質の量を決定する。 </li></ol></li></ol></li><li> サイト特異的突然変異体を用いたインビトロ AMPK活性アッセイ NOTE： インビトロ AMPKキナーゼアッセイは、0.4μgの精製野生型GST-Nrf2またはGST-Nrf2-S558A突然変異体をペプチド阻害剤なしで使用して、工程2.2〜2.4に従って実施する。手順1で説明した放射線安全ガイドラインにすべて従ってください。 <ol><li> 0.15μgのAMPK、0.4μgの変異型または野生型GST-Nrf2、および6μLの5キナーゼ緩衝液で氷上で反応バッファーを調製する。滅菌DWで30μLまで充填します。 </li><li>氷上で反応チューブに[γ- 32 P] -ATP（1μCi/μL）1μLを加えます。ピペットで上下に数回反応バッファーを混合し、遠心分離します。 </li><li>サンプルを30℃の加熱ブロックで30分間インキュベートする。 </li><li> 3μLの10×SDSサンプルバッファーを加えてキナーゼ反応を停止させます。 </li><li> 7.5％SDS-PAGEゲル中、70Vで20分間、次いで140Vで1時間実行する。 </li><li>固定緩衝液でゲルを20分間固定し、それを濾紙上に移し、透明体でゲルを覆うentラッパー。 </li><li>真空ゲル乾燥機でゲルを80℃で1時間乾燥させ、蛍光体スクリーンまたはX線フィルムのいずれかに一晩さらす。 </li><li>蛍光体イメージャで蛍光体スクリーンをスキャンし、ステップ2.4に従って可視化した後、CBB染色のためにゲルをガラス管に移す。 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hardie, D. G., Schaffer, B. E., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK:+An+energy-sensing+pathway+with+multiple+inputs+and+outputs.">AMPK: An energy-sensing pathway with multiple inputs and outputs.</a> Trends Cell Biol. 26, 190-201 (2016).</li><li>Gwinn, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK+phosphorylation+of+raptor+mediates+a+metabolic+checkpoint.">AMPK phosphorylation of raptor mediates a metabolic checkpoint.</a> Mol Cell. 30, 214-226 (2008).</li><li>Huang, H. C., Nguyen, T., Pickett, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+Nrf2+at+Ser-40+by+protein+kinase+C+regulates+antioxidant+response+element-mediated+transcription.">Phosphorylation of Nrf2 at Ser-40 by protein kinase C regulates antioxidant response element-mediated transcription.</a> J Biol Chem. 277, 42769-42774 (2002).</li><li>Niture, S. K., Jain, A. K., Jaiswal, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant-induced+modification+of+INrf2+cysteine+151+and+PKC-delta-mediated+phosphorylation+of+Nrf2+serine+40+are+both+required+for+stabilization+and+nuclear+translocation+of+Nrf2+and+increased+drug+resistance.">Antioxidant-induced modification of INrf2 cysteine 151 and PKC-delta-mediated phosphorylation of Nrf2 serine 40 are both required for stabilization and nuclear translocation of Nrf2 and increased drug resistance.</a> J Cell Sci. 122, 4452-4464 (2009).</li><li>Jain, A. K., Jaiswal, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GSK-3beta+acts+upstream+of+Fyn+kinase+in+regulation+of+nuclear+export+and+degradation+of+NF-E2+related+factor+2.">GSK-3beta acts upstream of Fyn kinase in regulation of nuclear export and degradation of NF-E2 related factor 2.</a> J Biol Chem. 282, 16502-16510 (2007).</li><li>Steen, H., Jebanathirajah, J. A., Rush, J., Morrice, N., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+analysis+by+mass+spectrometry:+myths,+facts,+and+the+consequences+for+qualitative+and+quantitative+measurements.">Phosphorylation analysis by mass spectrometry: myths, facts, and the consequences for qualitative and quantitative measurements.</a> Mol Cell Proteomics. 5, 172-181 (2006).</li><li>Dephoure, N., Gould, K. L., Gygi, S. P., Kellogg, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+analysis+of+phosphorylation+sites:+a+quick+guide+for+cell+biologists.">Mapping and analysis of phosphorylation sites: a quick guide for cell biologists.</a> Mol Biol Cell. 24, 535-542 (2013).</li><li>Joo, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK+facilitates+nuclear+accumulation+of+Nrf2+by+phosphorylating+at+Serine+550.">AMPK facilitates nuclear accumulation of Nrf2 by phosphorylating at Serine 550.</a> Mol Cell Biol. 36, 1931-1942 (2016).</li><li>Sinclair, W. K., Holloway, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Half-lives+of+some+radioactive+isotopes.">Half-lives of some radioactive isotopes.</a> Nature. 167 (4244), 365 (1951).</li><li>Chang, B. Y., Chiang, M., Cartwright, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+Src+and+RACK1+is+enhanced+by+activation+of+protein+kinase+C+and+tyrosine+phosphorylation+of+RACK1.">The interaction of Src and RACK1 is enhanced by activation of protein kinase C and tyrosine phosphorylation of RACK1.</a> J Biol Chem. 276, 20346-20356 (2001).</li><li>Smith, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RACK1+interacts+with+filamin-A+to+regulate+plasma+membrane+levels+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">RACK1 interacts with filamin-A to regulate plasma membrane levels of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 305 (1), C111-C120 (2013).</li></ol>

著者は何も開示することはない。

AMPKが仲介する予測されるリン酸化部位の真正性を評価する簡単で便利な方法として、競合的なペプチドを用いて特異的なリン酸化部位を発見し、部位特異的突然変異体を用いて検証するために使用できるin vitroキナーゼアッセイをここで説明する。 。 インビトロ競合的AMPK活性アッセイから得られた代表的なデータは、部位特異的突然変異タンパク質を用いたアッセイの結果と...

特定の残基でのタンパク質リン酸化は、広範囲の細胞プロセスにおいて重要な役割を果たす。従って、シグナル伝達ネットワークの理解は、特異的なリン酸化部位の同定を必要とする。さらに、リン酸化部位は、タンパク質内の個々のドメインが異なる構造および機能を有するため、タンパク質機能に対する効果を決定する。主要な抗酸化転写因子である核因子エリトロイド2関連因子2（Nrf2）の活性は、異なる部位でのリン酸化によって双方向的に調節される。我々の研究は、Nrf2のリン酸化を触媒するキナーゼに焦点を当てている。酸化チャレンジに対するNrf2のストレス応答は、主にセリン40でのリン酸化を介して急速に起こり、Nrf2を活性化するプロテインキナーゼC（PKC）-δによって媒介される3,4 。逆に、Fynは、チロシン5でNrf2の阻害的リン酸化を触媒するアクティビティの厳密な制御のために68。 リン酸化部位を発見するために使用される最も一般的な方法は、液体クロマトグラフィー/質量分析（LC / MS）分析である。迅速かつ高感度なリン酸化部位マッピングデータをこのように生成することができる。しかし、それにはいくつかの技術的な制限があり、しばしば偽陰性シグナルが生成されます。シーケンスのカバレッジが悪いと、LC / MS分析で頻繁に発生します。リン酸化部位を同定するためには、タンパク質の最大アミノ酸含量に関する情報が必要である6 。消化工程中のいくつかのプロテアーゼによる目的タンパク質のタンパク質分解は、配列カバレッジを改善するのに役立つ可能性がある。リン酸化残基の同定のためのもう一つの障害は、セリンおよびトレオニンリン酸化ペプチドでしばしば観察されるリン酸の容易な損失である6,7。不安定なリン酸部分はしばしば断片化プロセス中にホスホペプチドから放出される。リン酸化部位を探索する場合の第2の選択肢は、ペプチドマイクロアレイ法を用いることである。目的のタンパク質に由来するペプチド断片を含むマイクロアレイチップを用いて、キナーゼ標的部位をスクリーニングすることが可能である。しかしながら、マイクロアレイチップの製造および検出のための装置要件のために、ペプチドマイクロアレイ法は時間がかかりかつ高価であると考えられている。 これらの課題を克服するために、インビトロオリゴペプチド競合キナーゼアッセイを、既知の認識モチーフを有するプロテインキナーゼのために使用することができる。キナーゼのコンセンサス認識モチーフが確立されれば、候補基質の推定上のリン酸化部位を予測することができ、部位の真正性を確認することができる。この手順の最も説得力のある方法は、突然変異体タンパク質におけるリン酸化の抑止を示すことであり、このタンパク質では、d残基は、非リン酸化性アミノ酸（ すなわち、セリンまたはトレオニンからアラニン;チロシンからフェニルアラニン）で置換される。しかしながら、突然変異体タンパク質の産生および単離は時間がかかる。研究の初期段階における選択肢として、競合的ペプチドキナーゼアッセイは簡単で便利である。ここでは、 インビトロペプチド競合アッセイおよびリン酸化部位の確認のためのプロトコールについて記載する。

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>208337</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-glycerophosphate</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;VO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Calbiochem, Nottingham, UK</td><td>539134</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>AMP</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A1752</td><td></td></tr><tr><td>AMPK</td><td>Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY</td><td>14-840</td><td></td></tr><tr><td>Nrf2 (WT)</td><td>Abnova, Taipei City, Taiwan</td><td>H00004780-P01</td><td></td></tr><tr><td>[&amp;gamma;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P]-ATP</td><td>PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA</td><td>NEG502A</td><td></td></tr><tr><td>EZblue staining reagent</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>G1041</td><td></td></tr><tr><td>Pfu turbo DNA polymerase</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td><td>600250</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td><td>200415-51</td><td>Avoid multiple thaw and freezing cycle</td></tr><tr><td>DpnI</td><td>New England Biolabs, Ipswich, MA</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>LB broth</td><td>Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Netherlands</td><td>L1704</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Affymetrix, Santa Clara, CA</td><td>11259</td><td></td></tr><tr><td>Agarose LE</td><td>iNtRON Biotechnology, Sungnam, South Korea</td><td>32034</td><td></td></tr><tr><td>HiYield Plus Gel/PCR DNA Mini Kit</td><td>Real Biotech Corporation, Taipei, Taiwan</td><td>QDF100</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>161-0400</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Bovogen Biologicals, Victoria, Australia</td><td>BSA100</td><td></td></tr><tr><td>Glutathione Sepharose 4B</td><td>GE Healthcare, Marlborough, MA</td><td>17-0756-01</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid glacial</td><td>Duksan pure chemicals, Ansan, South Korea</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methyl alcohol&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;</td><td>Daejung Chemicals &amp;amp; Metals, Siheung, South Korea</td><td>5558-4410</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Typhoon FLA 7000</td><td>GE Healthcare, Marlborough, MA</td><td>28-9558-09</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE kit</td><td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>1658001FC</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum pump</td><td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>165-178</td><td></td></tr><tr><td>Gel dryer</td><td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>165-1746</td><td></td></tr><tr><td>Dancing shaker</td><td>FINEPCR, Seoul, Korea</td><td>CR300</td><td>The machine is needed for washing step</td></tr><tr><td>PCR machine</td><td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>T100</td><td></td></tr><tr><td>Incubator/shakers</td><td>N-BIOTEK, GyeongGi-Do, Korea</td><td>NB-205L</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuges</td><td>LABOGENE, Seoul, Korea</td><td>1730R</td><td></td></tr><tr><td>Chromatography columns</td><td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>732-1010</td><td></td></tr></tbody></table>

oligopeptide competition assay for phosphorylation site determination

特定の部位でのタンパク質のリン酸化は、その立体配座および他の分子との相互作用を決定する。したがって、タンパク質のリン酸化は、細胞の生物学的機能および特性に影響を及ぼす。現在、リン酸化部位を発見するための最も一般的な方法は、迅速かつ高感度な方法である液体クロマトグラフィー/質量分析（LC / MS）分析によるものである。しかしながら、比較的不安定なリン酸部分は、しばしば偽陰性シグナルを生じる断片化段階の間にホスホペプチドから放出されることが多い。そのような場合、部位特異的突然変異体を用いる伝統的なインビトロキナーゼアッセイはより正確であるが、この方法は面倒で時間がかかる。したがって、ペプチド競合を用いる代替方法が有利であり得る。 5 &#39;アデノシン一リン酸活性化プロテインキナーゼ（AMPK）のコンセンサス認識モチーフが確立されており、位置スキャニングペプチドライブラリーを用いて検証したay 2 。したがって、新規基質のAMPKリン酸化部位は、ペプチド競合アッセイによって予測および確認することができた。この報告では、AMPK媒介性核因子赤血球2関連因子2（Nrf2）リン酸化を示すことにより、インビトロオリゴペプチド競合キナーゼアッセイの詳細なステップおよび手順を記載する。リン酸化部位を認証するために、我々は部位特異的突然変異体を用いて順次in vitroキナーゼアッセイを行った。全体として、ペプチド競合アッセイは、複数の潜在的なリン酸化部位をスクリーニングし、リン酸化部位突然変異体による検証のための部位を同定する方法を提供する。

図1と図2は、以前に報告された論文8の繰り返し実験の結果を示しています。推定上のAMPK標的部位を模倣する3つの異なる10残基オリゴペプチド（Ser153を含む＃1,148-157; Ser335を含む＃2,330-339;およびSer558を含む＃3,553〜562）を合成し、 inインビトロキナーゼアッセイ。 AMPKによるNrf2のリン酸化は、オリゴ...

Watch this Scientific Journal Video about Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination at JoVE.com

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

ペプチド競合アッセイは、種々の分子および免疫学的実験において広く使用されている。本稿では、in vitroオリゴペプチド競合キナーゼアッセイの詳細な方法と、特定のリン酸化部位を見出すのに有用な関連する検証手順について説明します。

リン酸化部位決定のためのオリゴペプチド競合アッセイ

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

oligopeptide-competition-assay-for-phosphorylation-site-determination

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.4K ビュー.  Seoul National University. ペプチド競合アッセイは、種々の分子および免疫学的実験において広く使用されている。本稿では、in vitroオリゴペプチド競合キナーゼアッセイの詳細な方法と、特定のリン酸化部位を見出すのに有用な関連する検証手順について説明します。 

ビデオ: Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering allosteric details of their regulation. Kinases comprise signaling networks whose defects are often hallmarks of multiple forms of cancer and related diseases, making an assay platform amenable to manipulation of upstream regulatory factors and validation of reaction requirements critical in the search for improved therapeutics. Here, we describe a basic kinase assay that can be easily adapted to suit specific experimental questions including but not limited to testing the effects of biochemical and pharmacological agents, genetic manipulations such as mutation and deletion, as well as cell culture conditions and treatments to probe cell signaling mechanisms. This assay utilizes radiolabeled [&#947;-32P] ATP, which allows for quantitative comparisons and clear visualization of results, and can be modified for use with immunoprecipitated or recombinant kinase, specific or typified substrates, all over a wide range of reaction conditions.

Protein kinases are highly evolved signaling enzymes and scaffolds that are critical for inter- and intracellular signal transduction. We present a protocol for measuring kinase activity through the use of radiolabeled adenosine triphosphate ([&#947;-32P] ATP), a reliable method to aid in elucidation of cellular signaling regulation.

放射性標識ATPによるタンパク質キナーゼ活性のアッセイ

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

生化学

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; however, the number of identified targets for Cdk1, particularly in human cells is still low. The identification of Cdk1-specific phosphorylation sites is important, as they provide mechanistic insights into how Cdk1 controls the cell cycle. Cell cycle regulation is critical for faithful chromosome segregation, and defects in this complicated process lead to chromosomal aberrations and cancer.
Here, we describe an in vitro kinase assay that is used to identify Cdk1-specific phosphorylation sites. In this assay, a purified protein is phosphorylated in vitro by commercially available human Cdk1/cyclin B. Successful phosphorylation is confirmed by SDS-PAGE, and phosphorylation sites are subsequently identified by mass spectrometry. We also describe purification protocols that yield highly pure and homogeneous protein preparations suitable for the kinase assay, and a binding assay for the functional verification of the identified phosphorylation sites, which probes the interaction between a classical nuclear localization signal (cNLS) and its nuclear transport receptor karyopherin &#945;. To aid with experimental design, we review approaches for the prediction of Cdk1-specific phosphorylation sites from protein sequences. Together these protocols present a very powerful approach that yields Cdk1-specific phosphorylation sites and enables mechanistic studies into how Cdk1 controls the cell cycle. Since this method relies on purified proteins, it can be applied to any model organism and yields reliable results, especially when combined with cell functional studies.

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is activated in the G2 phase of the cell cycle and regulates many cellular pathways. Here, we present a protocol for an in vitro kinase assay with Cdk1, which allows the identification of Cdk1-specific phosphorylation sites for establishing cellular targets of this important kinase.

サイクリン依存性キナーゼ 1 の同定の in Vitroキナーゼによって特定のリン酸化のサイトの試金します。

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets in both physiological and pathological states. CK2 is an evolutionarily conserved serine/threonine kinase with a growing list of hundreds of substrates involved in multiple cellular processes. Due to its pleiotropic properties, identifying and characterizing a comprehensive set of CK2 substrates has been particularly challenging and remains a hurdle in the study of this important enzyme. To address this challenge, we have devised a versatile experimental strategy that enables the targeted enrichment and identification of putative CK2 substrates. This protocol takes advantage of the unique dual co-substrate specificity of CK2 allowing for specific thiophosphorylation of its substrates in a cell or tissue lysate. These substrate proteins are subsequently alkylated, immunoprecipitated, and identified by liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). We have previously used this approach to successfully identify CK2 substrates from Drosophila ovaries and here we extend the application of this protocol to human glioblastoma cells, illustrating the adaptability of this method to investigate the biological roles of this kinase in various model organisms and experimental systems.

The objective of this protocol is to label, enrich, and identify substrates of protein kinase CK2 from a complex biological sample such as a cell lysate or tissue homogenate. This method leverages unique aspects of CK2 biology for this purpose.

多彩な生化学的アプローチを用いた新規 CK2 キナーゼ基板の識別

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important roles for the cell and may unravel new cellular processes. Among proteins, kinases are major actors as they belong to cell signaling pathways and have the ability to switch on or off many processes crucial to the fate of the cell, such as cell growth, division, differentiation, motility, and death.
In this study, we focused on a new potential kinase protein, LIMK2-1. We demonstrated its existence by Western Blot using a specific antibody. We evaluated its interaction with an upstream regulating protein using coimmunoprecipitation experiments. Coimmunoprecipitation is a very powerful technique able to detect the interaction between two target proteins. It may also be used to detect new partners of a bait protein. The bait protein may be purified either via a tag engineered to its sequence or via an antibody specifically targeting it. These protein complexes may then be separated by SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel) and identified using mass spectrometry. Immunoprecipitated LIMK2-1 was also used to test its kinase activity in vitro by &#947;[32P] ATP labeling. This well-established assay may use many different substrates, and mutated versions of the bait may be used to assess the role of specific residues. The effects of pharmacological agents may also be evaluated since this technique is both highly sensitive and quantitative. Nonetheless, radioactivity handling requires particular caution. Kinase activity may also be assessed with specific antibodies targeting the phospho group of the modified amino acid. These kinds of antibodies are not commercially available for all the phospho modified residues.

We characterized a new kinase protein using robust biochemical approaches: Western Blot analysis with a dedicated specific antibody on different cell lines and tissues, interactions by coimmunoprecipitation experiments, kinase activity detected by Western Blot using a phospho-specific antibody and by &#947;[32P] ATP labeling.

新しいキナーゼタンパク質の堅牢な生化学的アプローチを用いて分子レベルでの特性解析

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of PNKs can be quantified using direct or indirect approaches. Presented here is a direct, in vitro approach to measure PNK activity that relies on a fluorescently-labeled oligonucleotide substrate and polyacrylamide gel electrophoresis. This approach provides resolution of the phosphorylated products while avoiding the use of radiolabeled substrates. The protocol details how to set up the phosphorylation reaction, prepare and run large polyacrylamide gels, and quantify the reaction products. The most technically challenging part of this assay is pouring and running the large polyacrylamide gels; thus, important details to overcome common difficulties are provided. This protocol was optimized for Grc3, a PNK that assembles into an obligate pre-ribosomal RNA processing complex with its binding partner, the Las1 nuclease. However, this protocol can be adapted to measure the activity of other PNK enzymes. Moreover, this assay can also be modified to determine the effects of different components of the reaction, such as the nucleoside triphosphate, metal ions, and oligonucleotides.

This protocol describes a nonradioactive assay to measure kinase activity of polynucleotide kinases (PNKs) on small DNA and RNA substrates.

小ヌクレオチド基質のポリヌクレオチドリン酸化を測定する非放射性アッセイ

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to measure protein phosphorylation cannot preserve the heterogeneity in phosphorylation across individual proteins. The single-molecule pull-down (SiMPull) assay was developed to investigate the composition of macromolecular complexes via immunoprecipitation of proteins on a glass coverslip followed by single-molecule imaging. The current technique is an adaptation of SiMPull that provides robust quantification of the phosphorylation state of full-length membrane receptors at the single-molecule level. Imaging thousands of individual receptors in this way allows for quantifying protein phosphorylation patterns. The present protocol details the optimized SiMPull procedure, from sample preparation to imaging. Optimization of glass preparation and antibody fixation protocols further enhances data quality. The current protocol provides code for the single-molecule data analysis that calculates the fraction of receptors phosphorylated within a sample. While this work focuses on phosphorylation of the epidermal growth factor receptor (EGFR), the protocol can be generalized to other membrane receptors and cytosolic signaling molecules.

The present protocol describes sample preparation and data analysis to quantify protein phosphorylation using an improved single-molecule pull-down (SiMPull) assay.

タンパク質リン酸化の定量のための最適化された1分子プルダウンアッセイ

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with cytoplasmic tails of the receptors. The interactions often occur through specific protein domains and result in activation of the enzymes. There are several methods to study interactions between proteins. While co-immunoprecipitation is commonly used to study domains that are required for protein-protein interactions, there are no assays that document the contribution of specific domains to activity of the recruited enzymes at the same time. Accordingly, the method described here combines co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay for simultaneous evaluation of interactions between proteins and associated enzymatic activation. The goal of this protocol is to identify the domains that are critical for physical interactions between a protein and enzyme and the domains that are obligatory for complete activation of the enzyme. The importance of this assay is demonstrated, as certain receptor protein domains contribute to the binding of the enzyme to the cytoplasmic tail of the receptor, while other domains are necessary to regulate the function of the same enzyme.

Here, we present a protocol for co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay to simultaneously study the contribution of specific protein domains of plasma membrane receptors to both enzyme recruitment and enzyme activity.

受容体と酵素間の機能的相互作用を研究するため Co 免疫沈降分析

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

免疫・感染学

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

植物タンパク質複合体の翻訳後修飾の同定

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

生物学

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

ハイスループットスクリーニングを使用したキナーゼ基質ペアの同定


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Comparing the Affinity of GTPase-binding Proteins using Competition Assays

In this protocol we demonstrate a method for comparing the competition between GTPase-binding proteins. Such an approach is important for determining the binding capabilities of GTPases for two reasons: The fact that all interactions involve the same face of the GTPases means that binding events must be considered in the context of competitors, and the fact that the bound nucleotide must also be controlled means that conventional approaches such as immunoprecipitation are unsuitable for GTPase biochemistry. The assay relies on the use of purified proteins. Purified Rac1 immobilized on beads is used as the bait protein, and can be loaded with GDP, a non-hydrolyzable version of GTP or left nucleotide free, so that the signaling stage to be investigated can be controlled. The binding proteins to be investigated are purified from mammalian cells, to allow correct folding, by means of a GFP tag. Use of the same tag on both proteins is important because not only does it allow rapid purification and elution, but also allows detection of both competitors with the same antibody during elution. This means that the relative amounts of the two bound proteins can be determined accurately.

This protocol compares the relative affinities of binding partners for Rho-family GTPases, including Rac1. In vivo, Rac1-binding proteins compete for a single binding interface, the conformation of which is dictated by a bound nucleotide. The nucleotide is both important and difficult to control experimentally, due to the high hydrolysis rate.

競合アッセイを使用してGTPアーゼ結合タンパク質の親和性を比較すると、

In this protocol we demonstrate a method for comparing the competition between GTPase-binding proteins. Such an approach is important for determining the ...