このプロトコルは、哺乳類の頭蓋顔面発達中に活性なリンタンパク質のダイナミクスおよび役割についてのより大きな洞察を得るために使用することができる。このプロトコールは、2つの生理学的に関連する文脈、マウス顔面プロセスおよび培養マウス胚性口蓋間葉系細胞からのタンパク質単離中の脱リン酸化の共通の障壁を克服する。すべての試薬と材料を氷上に保持しながら迅速に移動し、リン酸化タンパク質の完全性を維持するためにすべての溶解バッファーにホスファターゼ阻害剤を使用することが不可欠です。
まず、腹側を上に向けてマウスの体を解剖ボードの上に置き、マウス腹部に70%エタノールを噴霧します。次に、まっすぐなせんけ鉗子で膣口に前部の皮膚をつまんで持ち上げて腹腔を開きます。次に、持ち上げた皮膚を下層に、直刃の外科用ハサミで両側の45度の角度で切断し、四肢と後肢のほぼ中間のそれぞれの側方面まで伸びるV字型を生成する。
Semken鉗子を使用して、子宮角の1つをつかみ、外科用はさみで卵管の下と子宮頸部の上を切る。子宮角の完全な除去を可能にするために、メソメトリウムを切り取り、次いで解剖した子宮角を10センチメートルのペトリ皿中の10ミリリットルの組織学PBSに移す。同様に、腹腔の反対側にある第2の子宮角を除去する。
その後、両方の子宮の角が入った10センチのペトリ皿を氷の上に置きます。解剖実体顕微鏡下で、デュモン5個の細かい鉗子で子宮角から各胚を慎重に解剖する。その後、筋層、デシジュア、および絨毛膜をゆっくりと引き離す。
次に、胚を囲む比較的透明な羊膜を引き裂いて除去し、胚と胎盤をつなぐ臍帯を切断する。次いで、切断されたプラスチック転写ピペットを用いて氷上の12ウェル細胞培養プレートの個々のウェル中の組織学PBSの2.5ミリリットルに各解剖胚を移す。10ミリリットルの組織学PBSを含む3つの10センチメートルのペトリ皿を準備し、胚間の回転に使用するためにそれらを氷の上に保管する。
次いで、12ウェル細胞培養プレートの個々のウェルから、切断されたプラスチック転写ピペットを用いて氷上の組織学PBSを用いて10センチメートルのペトリ皿の1つに1つの胚を移す。解剖顕微鏡下で、上顎突起で外鼻突起を隔てる自然のくぼみに沿って、まず1つの上顎突起の前側に切り込みを入れ、細かい鉗子を用いて各上顎突起を顔面から分離する。次に、上顎突起と下顎突起とを隔てる自然のくぼみに沿って上顎突起の後側を切断する。
次に、上顎突起の眼側で上顎突起の前側から後側に向かって垂直に切断することによって上顎突起を完全に分離する。2ミリリットルの小さなラテックス電球を備えた9インチパスツールピペットを使用して、約30マイクロリットルの組織学PBSの小さな液滴で解剖された一対の上顎プロセスを氷上のラベル付き35ミリメートルペトリ皿に移す。次いで、一対の上顎プロセス組織を、パスツールピペットを用いて氷上の標識された1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移し、組織学PBSの移送を最小限に抑えた。
さらに、パスツールピペットで1.5ミリリットルの微量遠心チューブ内の過剰な組織像PBSを除去します。氷上での使用直前にプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を添加した0.1ミリリットルの氷冷NP40溶解緩衝液を加える。その後、200マイクロリットルのピペットマンで10回ピペットを上下させます。
次に、10秒間ボルテックスし、気泡の発生を避けながら、200マイクロリットルのピペットマンで10回上下にピペットした。チューブリボルバー付きの1.5ミリリットルまたは2ミリリットルのパドルを使用してエンドオーバーエンドで回転させながら、摂氏4度で2時間インキュベートします。その後、サンプルを13, 500 x gで摂氏4度で20分間遠心分離し、上清を200ミリリットルのPIPETMANで氷上の新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに集めます。
まず、真空系に取り付けられた5.75インチパスツールピペットを用いてマウス胚性口蓋間葉系細胞から培地を吸引する。次いで、氷冷した組織培養PBSで細胞を2回洗浄し、最後の洗浄中にプレートを横に傾けて、すべての組織培養PBSが吸引されるようにする。次に、氷上で使用直前にプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を添加した氷冷NP40溶解バッファーを添加し、細胞を溶解する。
プレートを氷上で5分間インキュベートし、プレートを完全にカバーできるように、ほぼ毎分回転させます。次いで、予め冷却されたセルリフターを用いてプレートから細胞をこすり落とし、細胞懸濁液を氷上の予冷却された1.5ミリリットルの微量遠心管に移した。その後、チューブリボルバーで1.5ミリリットルまたは2ミリリットルのパドルを使用してエンドオーバーエンドで回転させながら、細胞懸濁液を摂氏4度で30分間インキュベートします。
その後、サンプルを13, 500 x gで摂氏4度で20分間遠心分離し、上清を200ミリリットルのPIPETMANで氷上の新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに集めます。PDFG-Bリガンドによる刺激を2~15分間行った不死化マウス胚性口蓋間葉系細胞からの全細胞溶解物のウェスタンブロット分析により、対応する全タンパク質バンドの高さまたはその近くで走るリンタンパク質の明確な再現性バンドが明らかになった。リンタンパク質バンド強度の増加は、未処理の細胞と比較して成長因子で処理すると観察されたが、総タンパク質バンド強度はサンプル間で比較的同等であった。
このプロトコルは、摂動およびリン酸化が頭蓋顔面状況における細胞間シグナル伝達、遺伝子発現、および細胞活動に直接どのように影響するかを調べるために使用することができる。
