イノシトールリン酸およびホスホイノシチドは、真核生物におけるいくつかの調節機能を有する代謝産物であり、遺伝子発現の制御、タンパク質の密売、シグナル伝達、細胞の発達などである。タンパク質に結合することによりこれらの調節機能を実行し、それによってタンパク質の立体構造、触媒活性、またはタンパク質相互作用を変化させる。イノシトールリン酸またはホスホイノシチドに結合するタンパク質の同定は、それらの代謝産物がそれらの調節機能を実行する方法を理解するために不可欠です.
このプロトコルは、敏感な、非放射性、リポソームフリーであり、市販されている試薬を使用する簡単なワークフローを有する。この方法では、ビオチン化イノシトールリン酸またはホスホイノシチドを用いた完成したクロマトグラフィーを、相互作用タンパク質を単離するために使用され、次いで、ウェスタンブロット、または質量分析によって同定される。血流形態の場合、T.ブルシ細胞をHMI-9培地の中ログ相まで成長させ、摂氏37度で10%FBSを補い、5%の二酸化炭素を有する。
1 ミリリットル当たり 800,000,160 万個の細胞の間の細胞密度を保ちます。準備ができたら、細胞を1600倍Gで遠心し、室温で10分間遠心する。上清を捨て、細胞を洗浄するために摂氏37度で予熱したPBS-Gの10ミリレトレでペレットを穏やかに再懸濁する。
細胞を1600倍Gで遠心し、室温で5分間洗浄を完了します。この洗浄手順をさらに2回繰り返します。その後、PBS-Gの1ミリリットルでペレットを再懸濁する。
この懸濁液を1点5ミリリットルチューブに移し、その後1600倍Gで5分間遠心分離機を入れます。上澄み液を捨て、ペレットをゼロポイント5ミリリットルのリシスバッファーに再懸濁し、1ポイント5 Xプロテアーゼ阻害剤カクテルと、氷上で予冷した1つのXホスファターゼ阻害剤カクテルを添加して細胞を融解する。1400倍Gで、摂氏4度で10分間、リゼートを遠心分離する。
この後、抽出された寄生虫タンパク質を含む上清を、結合アッセイ用の新しい1ポイント5ミリリットルチューブに集める。ウェスタンブロット分析のために、全リゼートの5%を確保します。アガロースビーズに結合したイノシトールリン酸塩またはホスホイノシチドの50マイクロリットルを収集し、500ミリリットルの結合バッファーを追加します。
1分間Gの1000倍で遠心分離機。上清を捨て、ビーズを平衡化するために50マイクロリットルの結合バッファーで再懸濁する。非コンジュゲートビーズをコントロールとして使用し、非リン酸化形態を含む異なるリン酸構成のビーズを使用して、非特異的相互作用を制御します。
次に、50マイクロリットルのIPビーズまたはPIビーズを細胞のライセートまたは精製したタンパク質に加えます。ビーズの量を全リセートの10%以内に保ちます。必要に応じて、結合反応の体積を調整するために結合バッファーを使用します。
50rpmで回転しながら、摂氏4度で1時間または一晩反応をインキュベートします。この後、1000倍Gで、摂氏4度で1分間遠心します。上清を取り除き、ペレットを保持し、ウェスタンブロット分析のために上清の5%を保つことを確認します。
その後、1ミリリットルの洗浄バッファーを追加し、チューブをタップまたは旋回して樹脂を再懸濁します。反応をGの1000倍、摂氏4度で1分間遠心し、上清を捨てる。このプロセスを合計 5 回の操作で繰り返します。
この後、ビーズに710ミリモル2-メルカプトエタノールを添加した2Xレムリバッファーの50マイクロリットルを追加します。タップまたは渦を混ぜて、タンパク質を希釈します。次に、摂氏95度で5分間、遠心分離機を10,000倍Gで1分間加熱します。
上清を収集し、マイナス80°Cで溶出物を凍結するか、ウェスタンブロット分析に進みます。ここで提示される方法は、T.brucei lysateからのリプレッサー活性化タンパク質1、または組換えT.bruceiリプレッサー活性化タンパク質1タンパク質によるPIの結合を分析するために使用される。RAP1は正規PI結合ドメインを欠いているため、結合アッセイは非リン酸化されたPI、またはイノシトール環の異なる位置でリン酸化されたPI、および非共役アガロースビーズで行われる。
西洋の分析によると、RAP1はPI(3, 4, 5)P3ビーズに優先的に結合するが、PI(4, 5)P2ビーズに対しては、より少ない程度に結合することも示している。しかし、他のピやアガロースビーズには結合しなかった。RAP1がピに直接結合するかどうかをテストするために、C末端にタグ付けされた6XHis組換えRAP1タンパク質を発現させ、大腸菌から均質に精製する。
ウエスタンブロッティングは、PI(3, 4, 5)P3の濃度を上げるが、PI(4, 5)P2ではなく、組換えRAP1とPI(3, 4, 5)P3ビーズとの相互作用を阻害することを示す。T.brucei精製PIP5Pase酵素を反応回復PI(3, 4, 5)組換えRAP1によるP3結合に添加した。これは、PI(3, 4, 5)P3のPIP5Pase脱リン酸化によるもので、この代謝物のリン酸化パターンがRAP1結合に不可欠であることを示しています。
Ins(1, 4, 5)P3に結合するT.bruceiタンパク質は、その後、質量分析法に続いてアフィニティークロマトグラフィーによって同定されます。SDS-PAGE分析は、コントロールアガロースビーズから溶出したタンパク質と比較して、Ins(1, 4, 5)P3ビーズから溶出したタンパク質の濃縮を示しています。対照ビーズと比較して、84個のタンパク質をIns(1, 4, 5)P3ビーズで濃縮した250以上のタンパク質を同定した溶出タンパク質の質量分析。
Ins(1, 4, 5)P3に結合したタンパク質の濃縮は、コントロールビーズと比較して、SDS-PAGEによって検出されたタンパク質シグナルと相関する。このプロトコルの重要なステップは、特定の特定の相互作用から特定を区別するために適切なコントロールを使用することです。非コンジュゲートアガロースビーズ、イノシトールリン酸またはホスホイノシチドと共役ビーズを使用することを推奨します。
この方法は、トリパノソーマクルシ、リーシュマニア、またはプラスモジウムのような他の単細胞原虫寄生虫に適用することができます。また、酵母や哺乳動物細胞を含む他の生物に容易に適応することができる。この方法は、SILACなどの定量的質量分析に結合して、イノシトールリン酸またはホスホイノチドとタンパク質の動的相互作用を同定することができる。
また、細胞内分別と組み合わせることができ、これらの代謝産物に結合するオルガネラ特異的タンパク質を同定する。このアプローチは、T.brucei、哺乳類細胞、および酵母におけるイノシトールリン酸およびホスホイノシチドに結合するタンパク質を同定するのに役立っています。これは、ホスホイノシチドに結合する新しいタンパク質ドメインを同定するのに役立っています。
これらの代謝産物の調節機能、真核生物における遺伝子発現、細胞の発達、シグナル伝達におけるその役割を理解する道が開かれた。このプロトコルの試薬の一部は、毒性、または可燃性です。個人的な保護具を使用し、必要に応じて、ヒュームフードで動作します。
