Le marquage des cellules souches et de leur descendance à l’aide d’une lignée transgénique inductible traçant la lignée de souris permet une analyse spatiale et temporelle de l’activation, de la prolifération, de la migration et/ou de la différenciation des cellules souches adultes dans le cerveau in vivo. Le traçage de la lignée peut révéler de nouvelles informations sur l’engagement de la lignée, la réponse aux interventions et la multipuissance. Les avantages des approches de traçage de lignée transgénique comprennent la spécificité du traçage d’une lignée cellulaire particulière, l’expression indélébile de la protéine fluorescente indépendamment du renouvellement ou de la différenciation cellulaire, la faible toxicité de la doxycyline, l’activation conditionnelle et la facilité d’utilisation avec des tests en aval courants sur les tissus traces de lignée, y compris l’immunocoloration et l’immunofluorescence.
En raison de la vaste implication de la plasticité et des cellules dans le cerveau adulte, la caractérisation et l’analyse des cellules souches adultes aideront à informer sur l’étude des maladies neurodégénératives, des impacts métaboliques sur la plasticité cérébrale, du vieillissement et d’autres conditions connexes. Pour commencer, faites glisser chaudement à la température ambiante et fixez-la avec de l’acétone glacée pendant 15 minutes. Lavez les lames pendant cinq minutes dans un tampon de rinçage 1X, en agitant à 60 rotations par minute à température ambiante entre chaque étape.
Perméabiliser pour la résistance des antigènes nucléaires avec 0,3% de Triton X-100 pendant 10 minutes à température ambiante. Perméabiliser pour la position debout des antigènes cytoplasmiques avec 0,3% Tween-20 pendant 10 minutes à température ambiante. Effectuer la récupération de l’antigène en micro-ondes sur des lames de 50 à 100 millilitres de 1x solution de récupération d’antigène DAKO à faible intensité pendant 10 minutes, deux fois.
Ensuite, rincez avec un tampon pendant cinq minutes à température ambiante. incuber les lames dans du Noir Typogène à 0,3 % dans de l’éthanol à 70 % pendant 20 minutes à température ambiante, puis les laver avec un tampon de rinçage. Dessinez la barrière hydrophobe autour des tissus.
Bloquer pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius avec un réactif bloquant. Et incuber avec un anticorps primaire dilué dans un diluant d’anticorps pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Lavez les lames pendant 10 minutes à température ambiante.
Le lendemain, incuber des sections dans des anticorps secondaires Alexa Fluor pendant 10 minutes à température ambiante. Ensuite, lavez les lames deux fois dans un tampon de rinçage pendant 10 minutes. Couvrir les sections du cerveau dans 100 microlitres d’un à 500 anticorps anti-GFP conjugués à AlexaFluor 488, et incuber pendant la nuit à quatre degrés Celsius pour stimuler le Fluor4 endogène, marquant les cellules tracées.
Le lendemain, laver avec un tampon de rinçage deux fois. Et puis laver à l’eau courante DI pendant cinq minutes. Contre-tache avec 100 nanogrammes par millilitre 4'6-diamidino-2-phénylindole pendant cinq minutes.
Ensuite, lavez à l’eau courante DI pendant cinq minutes. Ajoutez une goutte de support de montage fluorescent sûr sur le dessus de chaque section de tissu et scellez avec un couvercle de 22 millimètres par 22 millimètres. L’imagerie est recommandée le jour du montage pour assurer un signal optimal.
Pour commencer la fixation et la section après la perfusion transcardique post-fixation des cerveaux dans 4% PFA pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Et puis à nouveau pendant une heure à température ambiante. Laver le cerveau dans 1x PBS pendant une heure deux fois à température ambiante.
Coupez le cerveau en sections d’un millimètre d’épaisseur à l’aide du bloc cérébral sagittal et placez-le dans des tubes de microcentrifugation de cinq millilitres contenant 1x PBS. Pour le prétraitement au méthanol, commencez par laver avec 1x PBS pendant une heure deux fois à température ambiante. Laver à 50% de méthanol pendant une heure à température ambiante.
Laver à 80% de méthanol pendant une heure à température ambiante. Laver à 100% méthanol pendant une heure, deux fois, à température ambiante. Échantillons d’eau de Javel contenant 5 % de peroxyde d’hydrogène dans du sulfoxyde de diméthyle à 20 % et du méthanol à quatre degrés Celsius pendant la nuit.
Après le blanchiment, laver les échantillons dans du méthanol pendant une heure deux fois à température ambiante. Laver à 20% de diméthylsulfoxyde et méthanol pendant une heure deux fois à température ambiante. Laver à 80% de méthanol pendant une heure à température ambiante.
Laver à 50% de méthanol pendant une heure à température ambiante. Laver dans pbS pendant une heure deux fois à température ambiante. Laver dans PBS 0,2% Triton X-100 pendant une heure deux fois à température ambiante.
Pour l’immunocoloration des cerveaux clairsemés, commencez par incuber des échantillons dans 1x PBS, 0,2% Triton X-100, 20% DMSO, 0,3 glycine molaire, à 37 degrés Celsius pendant la nuit sur un agitateur orbital. Bloquer 1x PBS, 0,2% Triton X-100, 10% DMSO, 6% sérum de chèvre à 37 degrés Celsius pendant trois jours sur un agitateur orbital. Laver les échantillons dans 1x PBS, 0,2% Tween-20, 10 microgrammes par millilitres de sel d’héparine sodique de la muqueuse porcine pendant une heure deux fois à 37 degrés Celsius.
Ensuite, incuber dans 1x PBS, 0,2% Tween-20, 10 microgrammes par millilitres d’héparine, 5% DMSO, 3% de sérum de chèvre contenant une à 500 concentrations de lapin anti GFP AlexaFluor 488 à 37 degrés Celsius sur un agitateur orbital pendant deux jours. Laver les échantillons dans 1x PBS, 0,2% Tween-20 avec 10 microgrammes par millilitre d’héparine pendant une heure à 37 degrés Celsius sur un agitateur orbital trois fois, puis une fois par jour pendant deux jours. Incuber des échantillons pendant la nuit dans un millilitre de 50% de tétrahydrofurane et d’eau.
Incuber des échantillons pendant une heure dans un millilitre de tétrahydrofurane à 80% THF et d’eau. Incuber des échantillons deux fois pendant une heure dans du 100% tétrahydrofurane. Sécher les échantillons avec une lingette stérile et incuber dans du dichlorométhane jusqu’à ce qu’ils coulent au fond du flacon.
Ne pas incuber pendant plus de 60 minutes. Incuber des échantillons dans un millilitre d’éther dibenzylique jusqu’à ce qu’ils soient clairs. Conserver les échantillons dans de l’éther dibenzylique à température ambiante jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être photographiés.
Pour imager des sections du cerveau immunocolorées, analysez les lames par microscopie confocale, où la co-expression de plusieurs anticorps peut être confirmée. Nous utilisons un microscope Leica Stellaris cinq avec des détecteurs hybrides HyD S. Pour imager les cerveaux nettoyés, utilisez un microscope confocal inversé avec une scène automatisée et une fonction de carrelage automatisée.
Commencez par poser une section de cerveau dégagée à plat contre un plat à fond de verre immergé dans l’éther dibenzylique. Une différence notable d’intensité fluorescente entre différentes régions du cerveau et divers types de cellules a été observée après une période de chasse au pouls dans les cerveaux tracés par la lignée. Les cellules épithéliales choroïdes du plexus choroïde avaient une membrane cellulaire épaisse et un fort signal fluorescent vert indiquant qu’elles dérivaient de cellules Tert positives qui se distinguaient facilement des cellules environnantes.
Les autres types de cellules plus petites dans le stroma du plexus choroïde avaient un signal GFP plus faible. Dans le cervelet, les cellules gliales de Bergmann exprimaient des niveaux plus élevés de GFP que les cellules du panier, et une variation dans l’expression de la GFP existait également entre les cellules individuelles du panier. Pour les neurones sensoriels d’usine, les axones dans la couche glomérulaire du bulbe olfactif ont également exprimé des niveaux élevés de GFP Les axones sensoriels olfactifs qui remplissent la couche glomérulaire du bulbe olfactif ont exprimé des niveaux élevés de tomate membranaire, ou une fluorescence rouge par rapport à la plupart des autres régions du cerveau, même lorsque les mêmes neurones sont GFP positifs, ce qui indique que certaines cellules semblaient perdre le signal mTomato plus lentement pendant le traçage de la lignée.
En revanche, dans le plexus choroïde, les cellules GFP positives ont exprimé un faible mTomato. Dans la plupart des autres régions du cerveau, les signaux de la tomate étaient exprimés à faible niveau dans la plupart des types de cellules, les cellules endothéliales étant parmi les seules cellules dont le signal fluorescent était suffisamment lumineux pour se démarquer distinctement du fond fluorescent rouge du tissu cérébral. La chose la plus importante à retenir est que le signal fluorescent dans les cerveaux nettoyés s’estompe plus rapidement que la plupart des autres tests immunologiques.
N’oubliez pas d’imager vos échantillons dès que possible et dans les sept jours. Ensuite, l’imagerie des tranches de cerveau ou des cerveaux clairs, la colorisation des marqueurs avec les signaux GFP et notre quantification de la fluorence peuvent être entreprises à l’aide de logiciels.
