我々はMGFPのマウスのS.アーバーへと批判的に論文を読み、技術支援を提供ゼルバスの研究室のメンバーに感謝しています。 A.ブラウンは、脳科学カプランサマー大学院研究賞によってサポートされていました。 E.ノルマンは、脳科学研究プログラムの大学院研究賞によってサポートされていました。この研究はまた、スタートアップ研究資金（MZ）によって賄われていた。

タモキシフェンの準備と強制経口投与手順（E8.5） <ul><li>予め温めておいたコーン油にタモキシフェンを溶解することによりタモキシフェンの20 mg / mlのストック溶液を調製。 </li><li> 37ソリューションをインキュベート° C nutatorと断続的にボルテックスで2時間。 </li><li> 4の光、店舗° Cからタモキシフェン株式を保護し、一ヶ月までに使用。 </li><li>と遺伝子特異的クリアーT対立遺伝子とレポーターの対立遺伝子の両方を運ぶ男性の、運命のマッピングの実験のために、スイスウェブスター女性（タコニックから購入した野生型）で構成される繁殖のペアを確立する。 MGFP男性（Ellisor 2009）、デモンストレーションの目的のために、我々はWnt1 -クリアーTを使用しています。 </li><li>膣栓の外観のために毎朝スイスウェブスターの女性を確認してください。膣栓が0.5日後に性交と見られている日の朝（0900）を指定し、この出発点に基づいて、タモキシフェン投与の日付を計算する。 （この実験では、胎生8.5が使用されていた）。 </li><li>タモキシフェンのストック溶液（4 mgのタモキシフェン）の200μlを描画するために動物給餌針（20G X 1-1/2）1 mlシリンジを使用してください。 </li><li>しっかりと首の首筋をつかんで、時間妊娠スイスウェブスターの女性を抑制し、後頭部を固定し、腹側が上を向いているように裏返しますする。 </li><li>直線でボディを保つために無料の指の間に尾を保持する。 </li><li>口の端に送り針を置き、ゆっくりと口の屋根に沿って針を導く。 </li><li>それは首をまっすぐに戻すと同時に傾斜ヘッドながら、ボディと平行になるように針を回転させる。 </li><li>胃に向かって、食道の下方に針を導く。気管を入力しないように注意してください。針の抵抗、動物の咽頭反射が作動、またはマウスが闘争場合がある場合は、直ちに針を削除し、再度強制経口投与をしてみてください。 </li><li>送り針が胃になると、胃にタモキシフェンを投与し、解剖の日まで彼女の家のケージにメスを返します。 </li></ul>開頭術： <ul><li> Intracardially 4％PFAで成人の運命マッピングされたマウスを灌流し、ちょうど肩の上に脊柱を介してカットしてハサミで頭部を削除します。 </li><li>頭皮を切ってとスカルを公開するために、頭（尾に尾側）の背側正中線に沿ってメスを実行します。 </li><li>メスを使用して、頭蓋骨の側面と後部に沿ってから余分な組織や筋肉を削り取る。 </li><li>鉗子、穿刺だけで嗅球への吻側と細かいハサミの先端に対応するために小さな穴を作成正中線で頭蓋骨を持つ。 </li><li>この穴に素晴らしいはさみを挿入し、嗅球の外側約長さの切開を内側にします。このカットは、鼻の骨や前頭骨の交差点で頭蓋骨を切断し、はさみのための良好なアクセスを提供します。 </li><li>基盤となる組織の損傷を防ぐために、離れて脳からの角度、はさみのヒントをように注意しながら頭蓋骨の矢状縫合（背側正中線）に沿ってカット。 </li><li>ゆっくりと鉗子と皮離れて脳を露出させる内側の切開に沿って骨と頭蓋骨を把握する。頭蓋骨が小さな部分で、オフチップ以上のセクションに離れて壊れる可能性があります。前頭葉、頭頂葉、頭頂間、および後頭の骨のすべてを削除するには、鉗子を使用し続ける。 </li><li>両側に球状の骨をつまんでparaflocculiを（小脳のレベルでの脳の側縁に沿って位置）包む骨をクラック。ゆっくりと骨を引き離します。 </li><li>上下逆さまに頭を回して（下に背側）と脳神経を切断し、頭蓋骨から脳を解放するために鉗子を使用する。 </li></ul>全体のマウント顕微鏡：大人の脳<ul><li> GFPは、蛍光解剖スコープを使用してマーキングするために成人の脳を評価する。 </li><li> PBSとPictureFrameまたは他の適切なソフトウェアを使用して写真を含むペトリ皿に脳を転送する。 </li></ul>全体のマウント顕微鏡：E12.5胚<ul><li>蛍光解剖スコープを使用してGFPマーキングのための全体のマウントの胚を評価する。 </li><li> PBSとPictureFrameまたは他の適切なソフトウェアを使用して写真を含むペトリ皿に全部マウントして正のGFPであるものを転送します。 </li><li>各胚から尾の小片をオフに挟まないように鉗子を使用して、組織全体のマウント解析から見たときの結果を確認するために、両方の対立遺伝子のPCR（Ellisor 2009）を使用してPCRチューブおよび遺伝子型の各ピースを置きます。 </li></ul>顕微解剖およびE12.5胚から腹側中脳の外植片の準備<ul><li>子宮チェーンとIDから解剖以下ホールマウント蛍光、細胞培養皿の氷冷滅菌PBSに転送胚によって運命にマップされた胚のentification。 </li><li>細かいハサミを使用して、rhombomere 1〜尾横切断胚の頭部の部分を、削除してください。 </li><li>次に、間脳を介して冠状カットで頭の吻側部を削除してください。これは、背側と腹側の組織の間の導管中脳胞の形態を通じて第四脳室にチューブ状の構造を公開します。 </li><li>慎重に、&quot;オープンブック&quot;の準備を作成し、完全にチューブを開いて、吻側に尾側、背側正中線に沿ってはさみ第四脳室へのヒント、およびスニップを挿入します。中脳の二つ背側半分が横方向に配置される間、腹側中脳は、現在、内側に公開されます。 </li><li>もっときっぱりとレイアウトする組織のためのために、腹側中脳の下に残りのすべての非神経組織を削除します。なる必要がある場合は、外植片の背側&quot;翼&quot;だけでなく、平らになりますように吻側および尾側の面にノッチを作る。外植片は、今、&quot;背側中脳の翼を表している蝶、、とrhombomere 1尾のようになります。 </li><li>さらにFACS解析や細胞培養実験の腹側中脳を単離するために、組織の外側（背側面）を取り外します。 </li></ul>代表的な結果： このGIFM実験では、Wnt1発現細胞は永久にとheritably E8.5にWnt1 - CreERTでタモキシフェンを投与することにより、胚発生中にマークされています。MGFPの胚。その後、これらの顕著な細胞はWnt1由来細胞は、開発全体の神経構造に貢献する方法を決定するために全体のマウントの蛍光とセクション免疫組織化学を介して可視化しています。全体のマウント蛍光はMGFPレポーターの膜結合型GFPのコンポーネントに依存し、従って細胞の情報だけでなく、Wnt1由来神経突起の包括的なビューを提供します。主に中脳、後脳後部と脊髄でのE12.5展示GFPの蛍光でE8.5、Wnt1 - CreERTmGFP胚（図1A）でのタモキシフェン投与で、例えば。高倍率で、微細な神経細胞の突起は、中脳、体壁、四肢、および頭蓋顔面領域の神経支配見られている。この発達段階では、胚が透明で、内部のGFP標識は容易とに識別です。しかし、脳の発達として、成熟した組織の密度は、内部の脳の構造から発生するGFPの蛍光をあいまいにしています。したがって、E8.5でのタモキシフェン投与で、わずかなGFP標識は、全体のマウント蛍光（図1C、はめ込み）による成人の上丘で観察される。また、一部の軸索突起（図示せず）後脳の腹側表面に沿って走ること見られている。これとは対照的に、タモキシフェンがE9.5で投与されている場合、実質的なGFP標識は、全体の下丘（図1B、挿入図）を通じて行われます。全体のマウントの蛍光の増加は、E9.5でWnt1発現細胞は背側中脳の表面的な地域に、より大きく寄与するまたはE8.5からWnt1発現細胞よりも、この領域内に複数のプロセスを拡張することを示している可能性があります。関係なく、全体のマウントでこの違いは、蛍光は開発中のWnt1発現の動的な性質を反映しており、GIFMが成熟した大人に胚から別個の細胞集団を追跡するために使うことができる方法を示しています。 Wnt1 - CreERTから免疫組織化学、運命マッピングされた組織切片で、MGFPの動物は、細胞レベルで分析される。 GFP、β-ガラクトシダーゼ（β- gal）に対する抗体は、神経構造と細胞タイプへWnt1系統の微細細胞の寄与を決定するために組織特異的バイオマーカーの様々な組み合わせで使用されています。 E12.5においてE8.5でのタモキシフェン投与と組織の分析で、二重陽性細胞（GFP +とβ- galを+は）腹側中脳（図1B）を介して走ることの突起を持つ中脳と後脳全体に観察される。成人の脳で、E8.5でマークWnt1系統は腹側被蓋野のドーパミン作動性細胞集団の近くでだけでなく、優れたと下丘を含む多くの脳の構造を生じさせると黒質（図1D）（参照してくださいまたゼルバス2004）。対照的に、E9.5でマークWnt1 -系統は、ドーパミン作動性細胞集団（図1F）の近傍のニューロンにだけでなく、下丘を生じさせる。 <img src="/files/ftp_upload/1687/1687fig1.jpg" alt="図1" /> 図1 Wnt1 -運命のマッピングのための代表的な結果。： MGFP胚及びE8.5（AD）で（マーク）マップされた成人の脳の運命、ホールマウントとWnt1 - CreERTにおける免疫細胞化学結果の例とE9.5（EF）。 A. Wntシグナル1 -クリアー、主に中脳でのE12.5展示GFPの蛍光でMGFP胚（MB）、後方後脳（ヘモグロビン）と脊髄（Sp）を。 B.マーク細胞が可視化し、この1 -μmの厚さの光学部（40倍目標、Zシリーズの買収）に示すように、免疫組織化学により細胞レベルで分析した。 （nβ- gal）のβ-ガラクトシダーゼ核抗体標識（赤）とGFPの抗体標識（緑）は腹側中脳に示すように運命にマップされた細胞を示す。ここでは、組換え細胞がため、条件付きMGFPレポーターの性質の（nβ- GAL + / GFP +）ダブルポジティブです。 C.ホールマウント蛍光顕微鏡では大人の上丘（SC）（挿入図）でのかすかなGFPの蛍光を明らかにする。低倍率（5倍）顕微鏡で大人のセクションでE8.5でマークWnt1系統の評価は、Wnt1の系統が（IC）（SC）スーペリア、下丘（C）を含む中脳の構造を生じさせることがわかります。 D.nβ- GAL +細胞と豊富なGFP +軸索神経叢とのドーパミン作動性ニューロンの近傍の腹側中脳から採取した40倍速、1ミリメートル光学部。 E.は、容易に全体のマウント蛍光（挿入図）で中脳の下丘で観察される実質的なGFPの標識E9.5の結果でマーキング。低倍率（5倍）顕微鏡（E）で見られるような大人のセクション（β- galの+、赤）にE9.5でマークWnt1の系統は、下丘（背後部中脳）に集中している。 F.nβ- GAL +細胞と豊富なGFP +軸索神経叢とのドーパミン作動性ニューロンの近傍の腹側中脳から採取した40倍速、1ミリメートル光学部。 Wnt1の系統は腹側中脳への貢献に持続する間E8.5対E9.5でマークWnt1由来のニューロンが徐々に、背側中脳への貢献を制限されます。

<ol>
	<li>Ellisor, D., Koveal, D., Hagan, N., Brown, A., Zervas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+conditional+reporter+alleles+in+the+developing+embryo+and+embryonic+nervous+system.">Comparative analysis of conditional reporter alleles in the developing embryo and embryonic nervous system.</a> Gene Expr Patterns. 9, 475-489 (2009).</li><li>Zervas, M., Millet, S., Ahn, S., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+behaviors+and+genetic+lineages+of+the+mesencephalon+and+rhombomere+1.">Cell behaviors and genetic lineages of the mesencephalon and rhombomere 1.</a> Neuron. 43, 345-357 (2004).</li></ol>

すべての著者はこの作品にも同様に貢献し、アルファベット順にリストされています。各個人の貢献は、ビデオの記事で彼または彼女の参加によって明らかである。

我々が証明したというGIFMシステムは、細胞プロセスのさまざまな問題の広い範囲に答えるために使用することができます。例えば、異なるCreをドライバで改変マウスは、任意の細胞型、組織または興味の遺伝系統を対象とするために使用することができます。タモキシフェンは、任意の胚または出生後の時点で投与することができるので、さらに、組換えは、関連する発達段階をターゲット...

a practical approach to genetic inducible fate mapping: a visual guide to mark and track cells in vivo

運命のマップは、前駆細胞が開発し、成体の組織に固有の構造と細胞型に寄与する方法を決定するために生体内で細胞をマーキングして追跡することによって生成されます。このコンセプトの進歩は、 私は遺伝系統に基づいて、運命のマップを作成するには、Fは、遺伝子発現、細胞の運命、およびin vivoでの細胞の挙動を結ぶ、M apping（GIFM）を食べたnducible G eneticです。 Xは、修正されたバクテリオファージのタンパク質、Creリコンビナーゼ（ クリアーT）の空間的な発現を付与する遺伝子調節エレメントの遺伝子またはセットです。 クリアーTはクリアーTをレンダリングされた電子 strogen R eceptorのリガンド結合ドメインを含むGIFMエクスプロイトX -クリアーライン薬のタモキシフェンの存在下で細胞質に隔離。 loxP部位によって挟まれたDNA配列の間の核と仲介の再結合に移行しタモキシフェンリリースクリアーT、の結合。 GIFMでは、組換えは一般的にGFPなどのレポーター遺伝子の前にカセットを停止両側にloxP部位の間で発生します。 マウスは、地域、または細胞型特異的クリアーと条件レポーターの対立遺伝子のいずれかを含むように飼育されています。レポーターの停止カセットは、レポーター遺伝子のさらなる転写を防止するため未処理マウスは、マーキングしていないだろう。我々は、レポーターからストップカセットを取り外す核にクリアーTリリースの時間的制御とその後の転座を提供するタイムアウト妊娠女性への強制経口投与でタモキシフェンを投与する。再結合に続いて、レポーターの対立遺伝子は構成的であるとheritably表明した。この一連のイベントは、彼らの遺伝的履歴が消えないように記録されるようにセルをマークします。組換えレポーターは、このように最初にクリアーのTを駆動するために使用される遺伝子発現から切り離され、一度で、高忠実度遺伝子系統のトレーサーとしての役割を果たします。 我々は、成体細胞型や組織への遺伝的系統の正常な発達と把握するの貢献を研究するためにマウスでGIFMを適用します。我々はまた、より良い人間の遺伝疾患の顕著な特徴を模倣する複雑な表現型を理解するために変異体の遺伝的背景のセルに従うことをGIFM使用。 実験的な手法を通じて、このビデオの記事では、ガイドの研究者をうまくGIFMを適用する。日胚でタモキシフェンを投与することによって、MGFPマウス（E）8.5落射蛍光実体顕微鏡で12.5日で解剖し、分析に続いて強制経口投与を介して、私たちは、よく特徴付けWnt1 -クリアーTを用いる方法を示しています。我々はまた、外植片の準備またはFACS分析のために運命マッピングされたドメインをマイクロ細かく分析し、全体のマウント蛍光イメージングのために成人の運命マップの脳を解剖する方法を示します。総称し、これらの手順は、研究者は、発生生物学と疾患モデルの重要な質問に対処することができます。

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A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

遺伝的誘導フェイトマッピング（GIFM）マークと細かい空間的、時間的な制御を持つトラックの細胞<em&gt; in vivoで</em&gt;と、特定の遺伝系統の細胞が開発し、成体組織に貢献する方法解明。ここに示さ落射蛍光と植分析のために運命マップE12.5マウス胚に必要なテクニックがあります。

遺伝子誘導の運命のマッピングへの実践的アプローチ：マークとトラックの細胞へのビジュアルガイドインビボでの</em

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

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Research

JoVE Journal

Biology

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

16.7K ビュー.  Brown University. 遺伝的誘導フェイトマッピング（GIFM）マークと細かい空間的、時間的な制御を持つトラックの細胞 in vivoでと、特定の遺伝系統の細胞が開発し、成体組織に貢献する方法解明。ここに示さ落射蛍光と植分析のために運命マップE12.5マウス胚に必要なテクニックがあります。

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Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

初期のニワトリ胚をex vivo（新文化）の文化のための方法

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

生物学

A Magnetic Tether System to Investigate Visual and Olfactory Mediated Flight Control in Drosophila

It has been clear for many years that insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals track odors carried in the wind. As such, visual stabilization of upwind tracking directly aids in odor tracking. But do olfactory signals directly influence visual tracking behavior independently from wind cues? Also, the recent deluge of research on the neurophysiology and neurobehavioral genetics of olfaction in Drosophila has motivated ever more technically sophisticated and quantitative behavioral assays. Here, we modified a magnetic tether system originally devised for vision experiments by equipping the arena with narrow laminar flow odor plumes. A fly is glued to a small steel pin and suspended in a magnetic field that enables it to yaw freely. Small diameter food odor plumes are directed downward over the fly s head, eliciting stable tracking by a hungry fly. Here we focus on the critical mechanics of tethering, aligning the magnets, devising the odor plume, and confirming stable odor tracking.

Here we describe how to tether a fly in an olfactory magnetic-tether (OMT) apparatus. We describe how to align the rare-earth magnets and odor ports, and how to set mass flow rates for both the stimulus delivery and vacuum suction to achieve optimal odor tracking.

ショウジョウバエの視覚と嗅覚を介したフライトコントロールを調査するために磁気テザーシステム

It has been clear for many years that insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals track odors carried in the wind. ...

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In the zebrafish model, effective reverse genetic techniques have been developed using microinjection of gene-specific antisense morpholinos. Morpholinos target an mRNA through specific base-pairing and block gene function transiently by inhibiting translation or splicing for several days during embryogenesis (knockdown). However, in vertebrates such as mouse or zebrafish, some gene functions can be obscured by these approaches due to the presence of another gene that compensates for the loss. This is especially true for gene families containing sister genes that are co-expressed in the same developing tissues. In zebrafish, functional compensation can be tested in a relatively high-throughput manner, by co-injection of morpholinos that target knockdown of both genes simultaneously. Likewise, using morpholinos, a genetic interaction between any two genes can be demonstrated by knockdown of both genes together at sub-threshold levels. For example, morpholinos can be titrated such that neither individual knockdown generates a phenotype. If, under these conditions, co-injection of both morpholinos causes a phenotype, a genetic interaction is shown. Here we demonstrate how to show functional redundancy in the context of two related GATA transcription factors. GATA factors are essential for specification of cardiac progenitors, but this is revealed only by the loss of both Gata5 and Gata6. We show how to carry out microinjection experiments, validate the morpholinos, and evaluate the compensated phenotype for cardiogenesis.

Gene function can be obscured in loss-of-function experiments if there is compensation by another gene. The zebrafish model provides a relatively high-throughput means to reveal such functional redundancy in living embryos.

胚形成の間に機能的な冗長性をテストするための逆遺伝学的アプローチ

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

テラトーマ形成により、ヒト胚性幹細胞の運命のマッピング

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

ゼブラフィッシュにおける単一の細胞運命のマッピング

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal which tissues descend from each cell of the embryo. Although fate maps are very useful for identifying the precursors of an organ and for elucidating the developmental path by which the descendant cells populate that organ in the normal embryo, they do not illustrate the full developmental potential of a precursor cell or identify the mechanisms by which its fate is determined. To test for cell fate commitment, one compares a cell's normal repertoire of descendants in the intact embryo (the fate map) with those expressed after an experimental manipulation. Is the cell's fate fixed (committed) regardless of the surrounding cellular environment, or is it influenced by external factors provided by its neighbors? Using the comprehensive fate maps of the Xenopus embryo, we describe how to identify, isolate and culture single cleavage stage precursors, called blastomeres. This approach allows one to assess whether these early cells are committed to the fate they acquire in their normal environment in the intact embryo, require interactions with their neighboring cells, or can be influenced to express alternate fates if exposed to other types of signals.

The fate of an individual embryonic cell can be influenced by inherited molecules and/or by signals from neighboring cells. Utilizing fate maps of the cleavage stage Xenopus embryo, single blastomeres can be identified for culture in isolation to assess the contributions of inherited molecules versus cell-cell interactions.

胚発生時に細胞運命のコミットメントをテストするために割球植

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

A Practical Guide to Phylogenetics for Nonexperts

Many researchers, across incredibly diverse foci, are applying phylogenetics to their research question(s). However, many researchers are new to this topic and so it presents inherent problems. Here we compile a practical introduction to phylogenetics for nonexperts.&#160;We outline in a step-by-step manner, a pipeline for generating reliable phylogenies from gene sequence datasets. We begin with a user-guide for similarity search tools via online interfaces as well as local executables. Next, we explore programs for generating multiple sequence alignments followed by protocols for using software to determine best-fit models of evolution. We then outline protocols for reconstructing phylogenetic relationships via maximum likelihood and Bayesian criteria&#160;and finally describe tools for visualizing phylogenetic trees. While this is not by any means an exhaustive description of phylogenetic approaches, it does provide the reader with practical starting information on key software applications commonly utilized by phylogeneticists. The vision for this article would be that it could serve as a practical training tool for researchers embarking on phylogenetic studies&#160;and also serve as an educational resource that could be incorporated into a classroom or teaching-lab.

Here we describe a step-by-step pipeline for generating reliable phylogenies from nucleotide or amino acid sequence datasets. This guide aims to serve researchers or students new to phylogenetic analysis.&#160;

Nonexpertsための系統学の実用ガイド

Many researchers, across incredibly diverse foci, are applying phylogenetics to their research question(s). However, many researchers are new to this ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

細胞特異的にLINC複合体を破壊するマウスモデルの検証

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to dose-limiting toxicity and many adverse side effects. Targeting the genome with sequence-specific small molecules may enable molecules with increased therapeutic index and fewer off-target effects. N-methylpyrrole/N-methylimidazole polyamides are molecules that can be rationally designed to target specific DNA sequences with exquisite precision. And unlike most natural transcription factors, polyamides can bind to methylated and chromatinized DNA without a loss in affinity. The sequence specificity of polyamides has been extensively studied in vitro with cognate site identification (CSI) and with traditional biochemical and biophysical approaches, but the study of polyamide binding to genomic targets in cells remains elusive. Here we report a method, the crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC), that identifies polyamide binding sites across the genome. COSMIC is similar to chromatin immunoprecipitation (ChIP), but differs in two important ways: (1) a photocrosslinker is employed to enable selective, temporally-controlled capture of polyamide binding events, and (2) the biotin affinity handle is used to purify polyamide&#8211;DNA conjugates under semi-denaturing conditions to decrease DNA that is non-covalently bound. COSMIC is a general strategy that can be used to reveal the genome-wide binding events of polyamides and other genome-targeting chemotherapeutic agents.

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Identifying the direct targets of genome-targeting molecules remains a major challenge. To understand how DNA-binding molecules engage the genome, we developed a method that relies on crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC).

COSMICと細胞の薬剤-DNA相互作用のゲノムワイドなマッピング（小分子の架橋は、クロマチンを分離するために）

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

ゼブラフィッシュにおける腎毒素マイクロインジェクションは急性腎障害をモデルに

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...