このプロトコルは、臨床固形腫瘍免疫療法モデルと、腫瘍細胞と浸潤免疫細胞との関係を研究するための研究プラットフォームを提供します。この細胞ベースの腫瘍ワクチンは、便利で使いやすく、チェックポイント遮断などの他の治療法と組み合わせて、より強力で高い腫瘍免疫をもたらすことができる相加的または相乗的な効果を達成することができます。手順のデモンストレーションを手伝うのは、私の研究室の研究技術者であるアン・バランシオです。
まず、B16-F10メラノーマ細胞をIMDMで培養し、10%熱不活性FBS、2ミリモルグルタミン、1ミリモルピルビン酸ナトリウム、1ミリモルMEM非必須アミノ酸、およびペニシリンとストレプトマイシンのそれぞれ1ミリリットルあたり100単位を含みます。細胞株を5%二酸化炭素で摂氏37度に維持します。B16-F10細胞を、本文に記載されているように播種して収穫します。
培養液を取り出し、フラスコをPBSで1回洗浄します。PBSを吸引し、5ミリリットルの0.25%トリプシン-EDTAを加え、続いて培養フラスコの縁を強くたたきます。15ミリリットルの培養液を加えてトリプシン-EDTAを中和し、フラスコの内容物を50ミリリットルの遠沈管に注ぎます。
皿の表面を10ミリリットルのPBSで洗い、同じ50ミリリットルの遠沈管に注ぎます。細胞を200 RCFで5分間遠心分離します。上清を捨て、チューブの底を指で軽くたたくことで細胞ペレットを壊します。
冷たい10ミリリットルのPBSを加え、細胞懸濁液を静かにピペットで固めます。次に、血球計算盤を使用して手動で細胞をカウントします。注射前に細胞を氷上に保管してください。
30ゲージ針を用いて、左脇腹の50マイクロリットルの冷たいPBSに500,000個の細胞B16-F10腫瘍細胞を皮内移植した。移植されたB16-F10腫瘍細胞の用量は、腫瘍発生を成功させるために50, 000〜500, 000細胞の範囲で調整する必要があるかもしれません。実施後、電子デジタルキャリパーを使用して週に3回腫瘍の長さと幅を測定します。
腫瘍体積を計算し、テキスト原稿に記載されているように腫瘍が2ミリメートルのサイズに達したときに腫瘍ワクチンでマウスを治療します。160キロボルト、25ミリアンペアに設定したX線照射器を用いて、150グレイ線量のガンマ線を細胞に照射する。注射前にトリパンブルー染色により細胞生存率をカウントして確認する。
100万個の照射B16-Flt3L細胞を50マイクロリットルの冷たいPBSにマウスに皮内注射し、元の腫瘍移植と同じ脇腹に注入します。最初の細胞移植後3、6、および9日目の原発腫瘍の部位から約1センチメートル。ワクチン注射部位を色付きのペンでマークして、原発腫瘍と区別します。
50, 000個のB16-F10細胞が最初に移植された場合、8、11、14日目にワクチン治療を行うことが推奨されます。各安楽死マウスから皮膚を有する腫瘍を外科的に除去し、それを1ミリリットルの10%FBS RPMI 1640培地を含む24ウェルプレートに入れた。腫瘍を2ミリリットルの消化バッファーで細かく切り、摂氏37度で25分間インキュベートします。
10ミリリットルの10%FBS RPMI 1640培地を加えて消化を停止します。25ミリリットルの血清学的ピペットを使用して、細胞を40マイクロメートルのセルストレーナーに移します。次に、1ミリリットルの注射器のプランジャーを使用して組織を粉砕します。
細胞を500 RCFで摂氏4度で5分間遠心分離します。ペレットを1倍濃度に希釈したPBS中の5ミリリットルの40%濃度勾配特異的培地に再懸濁します。PBSを含む5ミリリットルの80%密度勾配特異的培地の上に細胞懸濁液をゆっくりと加えます。
室温で23分間、低ブレーキ設定で325 RCFでセルに遠心分離します。遠心分離後、40%と80%の密度勾配特異的培地の間の界面にある白血球層を注意深く収集し、40マイクロメートルの細胞ストレーナーに通します。細胞を500 RCFで摂氏4度で5分間遠心分離します。
ペレットを2ミリリットルの赤血球溶解バッファー中で室温で5分間インキュベートします。インキュベーション後、10ミリリットルの10%FBS RPMI 1640培地を加えて、RBC溶解バッファーをクエンチします。細胞を400 RCFで摂氏4度で5分間遠心分離します。
細胞を0.5ミリリットルの10%FBS RPMI 1640培地に再懸濁し、さらなる分析のために使用前に細胞の総数を数えます。フローサイトメトリー分析による免疫細胞サブセットのゲーティング戦略のコントロールとして、脾臓または排液リンパ節を収集します。本文に記載されている細胞単離方法に従ってください。
移植されたB16-F10細胞の目に見える黒い点は、通常、腫瘍移植の約3日後に皮膚表面に観察されました。マウスは、腫瘍結節が2ミリメートルのサイズに達するか超えてから3、6、および9日後に腫瘍ワクチンで治療されました。腫瘍移植後約2週間でワクチン接種マウス群において有意な腫瘍増殖減少が観察された。
白血球層から採取した細胞は腫瘍細胞を多く含んでいるため、リンパ球集団を容易に定義することは困難であった。したがって、フローサイトメトリー分析における腫瘍内免疫細胞サブセットの適切なゲーティングのために、脾細胞を並行して使用しました。CD103陽性、CD11C陽性DC、CD8陽性、CD4陽性、およびTregのゲーティング戦略を補償マトリックスとともにプロットしました。
取得したアカウントの代表的なデータと各母集団の頻度も提供されました。ワクチン接種マウスからの腫瘍内CD103陽性、CD11C陽性DCは、共刺激性リガンドCD86の有意に上昇した発現を示した。ワクチン接種マウスはまた、CD8陽性およびCD4陽性、Foxp3陰性細胞、ならびにCD8陽性グランザイムB陽性およびインターフェロンガンマ陽性CTLにおける腫瘍浸潤の増加を示した。
原発腫瘍と腫瘍ワクチンとの間に十分な距離を保ってください。この物理的分離は、2つの腫瘍インプラント間の潜在的な融合を回避するために重要です。
