Name: generation of induced pluripotent stem cells from human melanoma tumor-infiltrating lymphocytes
Uploaded: 2016-11-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes at JoVE.com

We thank Ms. Deborah Postiff and Ms. Jackline Barikdar in the Tissue Procurement Core and Dr. Cindy DeLong in the Pluripotent Stem Cell Core Laboratory at the University of Michigan for her technical assistance. This study was supported by University of Michigan startup funding and grants from the Central Surgical Association, American College of Surgeons, Melanoma Research Alliance, and NIH/NCI (1K08CA197966-01) to F. Ito.

注：患者は、治験審査委員会に参加するためにインフォームドコンセントを与えるべきであり、ヒト多能性幹細胞の委員会は、研究を承認しました。 1.単離とのTILの文化<ol><li>病理サービス/組織の調達コアからの病理組織学的診断のために必要とされない腫瘍材料を入手します。メディアを収集する30ミリリットルの腫瘍（ 表1）を用いて50 mlチューブに腫瘍標本の20〜100グラムを置きます。 </li><li>固体、しっかりと、はさみを使用して、脆弱および/または血の壊死領域からの腫瘍標本の正常組織を解剖。壊死組織を除去した後、可能な限り小さく、試料をミンチするはさみを使用してください。 </li><li>製造者の指示に従って解離および腫瘍解離キット（ヒト）を使用して単一細胞懸濁液に刻んだ試料を解離させます。 50ミリリットルチューブに設定されている70μmのセルストレーナーでサスペンションを濾過して、ストレーナを2回洗浄RPMI1640培地2mlの。 </li><li> 5分間、室温で200×gで遠心分離します。上清を捨て、T細胞培地（ 表1）の10ミリリットル中に細胞を懸濁します。 </li><li> 100％勾配液及びダルベッコのリン酸で希釈した75％の勾配溶液30mlの中間ステップを10mlの下段で、50 mlチューブにかかるフィコール（勾配液）としての2段階勾配液を調製緩衝生理食塩水、無カルシウム、無マグネシウム（D-PBS（ - ））。 </li><li> （ステップ1.5）の勾配溶液に（工程1.4からの）細胞懸濁液レイヤ。 45分間20℃で400×gで遠心分離します。 </li><li> 100％勾配溶液、50 mlチューブ75％勾配液との界面に濃縮されたのTILを含む層を集め。 （ - ）D-PBS 20〜30 mlで添加することによって富化のTILの溶液の層を希釈します。 </li><li> 5分間、室温で200×gで遠心分離します。上清を捨て、10mlのTIL濃縮画分を再懸濁T細胞メディア。 </li><li> 37℃、5％CO 2で6ウェルプレート中のT細胞培地を2ml 6,000 IU / mlの組換えヒト（RH）IL-2との培養（工程1.8からの）画分。 </li><li>培養開始後5日目に半分メディアを変更し、その後2〜3日ごと。 </li><li> 80〜90％コンフルエントに達したとき、ウェルの数を2倍、そっと懸濁した後、トリプシン処理することなく、2：1の割合で細胞を分割します。 6000 IU / mlで新鮮なT細胞培地とのrhIL-2の半分の体積（1ミリリットル）を追加します。 </li></ol>マイトマイシンC処理したSNLフィーダー細胞プレートの調製<ol><li> 0.1％ゼラチンでコーティングした10cmディッシュ上のSNLフィーダー細胞培地（ 表1）10ml中の培養SNLフィーダー細胞を80〜90％コンフルエンス（3-4×10 6細胞）に到達するまで。 </li><li>直接SNLフィーダー細胞培養皿に0.4 mg / mlでマイトマイシンC溶液310μLを加え、37℃で2時間15分間、5％CO 2でインキュベートします。メディアAを吸引（ - ）ND 5ミリリットルのD-PBSで2回細胞を洗浄します。 </li><li> 0.5ミリリットル0.25％のトリプシン/ 1mMのEDTAを添加し、細胞を解離するために1分間室温でインキュベートします。単一の懸濁液に細胞を中和し、再懸濁するためにSNLフィーダー細胞培地の4.5ミリリットルを追加します。 </li><li> 5分間、200×gで15ミリリットルチューブと遠心分離機に細胞を移します。メディアを吸引し、SNLフィーダー細胞培地10mlに再懸濁した後、血球計算板を用いて細胞を数えます。 </li><li>プレート10cmディッシュ上のSNLフィーダー細胞のウェル当たり1.5×10 6細胞を、37℃、5％CO 2でインキュベートします。 3日以内のSNLフィーダー細胞を使用してください。 </li></ol>センダイウイルス（SeVの）ベクトルを用いたiPS細胞の3世代<ol><li> （ステップ1.11から）のTILを収穫し、プレート結合マウス抗ヒトCD3（1μg/ ml）および可溶性マウス抗ヒトCD28（5μg/ ml）でのTILの5×10 5細胞を活性化し、のrhIL-2と3で6ウェルプレート中のT細胞培地2ml中（6,000 IU / ml）を7℃で、5日間、5％CO 2。 </li><li>ピペットを用いて15mlチューブ（ステップ3.1）からのTILを採取し、血球計で細胞数を数えます。 </li><li> 500μlの中のrhIL-2（60 IU / ml）で、プレートに結合したマウス抗ヒトCD3（1μg/ mlの）および可溶性マウス抗ヒトCD28（5μg/ ml）でのTILの1×10 5個の細胞を再活性化37℃で24ウェルプレート中のウェルあたり再プログラム培地（ 表1）、24時間、5％CO 2の。センダイウイルス感染のための3つのウェルを準備します。OCT3 / 4、SOX2、KLF4、およびc-MYC（1ウェル）。センダイウイルス感染（GFP：緑色蛍光タンパク質）（1ウェル）。細胞数（1ウェル）。 </li><li> （ステップ3.3から）24時間後、血球計数器を用いて細胞数をカウントし、感染症の様々な（3-20）多重度（MOI）のために各ウイルスの量を決定します。 -80℃ストレージからセンダイウイルスベクター管の1セットを削除してください。水浴（37℃）で急速センダイウイルスベクターを解凍し、氷の上に置きます。 ウイルスの容量（μL）ウイルスの細胞/力価（CIU / ml）を×10-3（μL/ ml）を= MOI（CIU /セル）x個</li><li>活性化のTILを含む培地中に10〜20 MOIでセンダイウイルスベクターの混合物を添加することにより、個別にOCT3 / 4、SOX2、KLF4、およびc-MYCを担持4センダイウイルスベクターチューブのそれぞれの計算されたボリュームを追加します。 </li><li>形質導入効率を決定するために、活性化したのTILのウェルにのSeV-GFPの計算されたボリュームを追加します。 </li><li> 24時間、37℃、5％CO 2のインキュベーター内（ステップ3.5およびステップ3.6から）の皿を置きます。 24時間後、蛍光顕微鏡下でのSeV-GFPに感染したTILを使用して、感染効率を推定します。 </li><li> 15ミリリットルチューブに（ステップ3.5から）の細胞を収集します。 5分間、室温で200×gで遠心分離します。 </li><li>上清を捨て、霊長類ES細胞用培地および塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF、4 ngの/ ml）でのhESC培地0.5mlにペレットを再懸濁。 </li><li>コンタ10cmの皿にサスペンションを移しインのhESC培地10mlにSNLフィーダー細胞をマイトマイシンCで処理しました。コロニーが成長するまで一日おきのhESCのメディアを変更します。 </li><li> 18〜21日頃、クリーンベンチ内で10μlのチップを用いて、顕微鏡下でコロニーの周りのSNLフィーダー細胞を除去します。 </li><li> 10μlのチップを用いてコロニーを掻き取り、96ウェル組織培養プレートのウェルあたりiPS細胞培地100μlの中に200μlのチップを使用して転送します。 2-3時間で上下ピペット50から100ミクロンの平均サイズが小さな塊にコロニーを破壊します。 </li><li>塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF、4 NG / ml）を用いてiPS細胞培地のウェルあたり2ml中の（工程2から）マイトマイシンC処理したSNLフィーダー細胞を6ウェル組織培養プレートに小塊を移します。毎日iPS細胞のメディアを変更します。 </li><li>すべての5-6日に1mg / mlのコラゲナーゼIVで新鮮マイトマイシンC処理したSNLフィーダー細胞を6ウェル組織培養プレートにiPS細胞を移します。 IMMUNのために各クローンのプレート当たり2つのウェルを準備ostaining。 </li><li>多能性マーカー（SSEA3、SSEA4、TRA-1-60、TRA-1-81、およびOCT3 / 4）1の免疫組織化学染色により各クローンの完全な再プログラミングを決定します。 注：多能性の可能性をさらに評価するために、完全に再プログラムIPSCラインが胚様体形成および分化アッセイまたはテラトーマ形成アッセイ16により三胚葉に分化することができることを確認します。 </li><li>完全に再プログラムIPSCラインは細胞遺伝学的解析により、正常な核型を示すことを確認してください。 </li><li>テラトーマ形成のために、6〜8週齢の雌NOD / SCIDマウスの皮下組織に10％FCSを含むDMEM100μl中の未分化TIL由来のIPSC（1×10 6）の懸濁液を注入します。ヘマトキシリンおよびエオシンで染色奇形腫セクション。 </li></ol> SSEA3、SSEA4、TRA1-60およびTRA1-81のためのiPS細胞の4.免疫蛍光染色<ol><li> 1 mlのPBSと4％のPAの1ミリリットルでiPS細胞を固定で洗浄性IPSC10分間raformaldehydeソリューション。 4％パラホルムアルデヒド溶液を除去し、1mlのPBSで3回iPS細胞を洗います。 注：パラホルムアルデヒドを使用しているとき、それは毒性があるので注意してください。 </li><li> 30分間緩衝液（ 表1）を遮断してiPS細胞を前処理。一方、PBSおよびトリトンで希釈した一次抗体（ラット抗ヒトSSEA3、マウス抗ヒトSSEA4、マウス抗ヒトTRA1-60、およびマウス抗ヒトTRA1-81）1時50分1.5％ヤギ血清溶液を希釈-100（総容量：1ミリリットル）。 </li><li>ブロッキングバッファー（ 表1）を取り外します。希釈した一次抗体溶液を加え、室温で1時間インキュベートします。一方、1.5％ヤギ血清溶液中で二次抗体（抗マウスIgGおよびIgMまたは抗ラットIgM抗体）1:50に希釈します。 </li><li>希釈した一次抗体溶液を除去し、1mlのPBSで3回、5分間ごとにiPS細胞を洗います。希釈された二次抗体溶液を添加し、暗室において室温で45分間インキュベートします。 </l私&gt; <li>希釈した二次抗体溶液を除去し、1mlのPBSで3回、5分間ごとにiPS細胞を洗います。免疫蛍光顕微鏡を用いてiPS細胞を観察します。 </li></ol> Oct3 / 4用のiPS細胞の5.免疫蛍光染色<ol><li> 1 mlのPBSと10分間、4％パラホルムアルデヒド溶液の1mlでiPS細胞を固定と洗浄性IPSC。 4％パラホルムアルデヒド溶液を除去し、PBSで3回iPS細胞を洗います。 </li><li>透過化緩衝液（ 表1）を加え、室温で10分間インキュベートします。透過化緩衝液を除去し、緩衝液（ 表1）をブロックに追加します。 </li><li>室温で30分間インキュベートします。一方、ブロッキング緩衝液中で一次抗体（マウス抗ヒトのOct3 / 4）1:50に希釈します。 </li><li>希釈した一次抗体溶液を加え、4℃で一晩インキュベートします。 </li><li>希釈した一次抗体溶液を除去し、5分間、PBSの1ミリリットルで3回、それぞれのiPS細胞を洗います。一方、ディブロッキング緩衝液で100：二次抗体（ヤギ抗マウスIgG / IgM抗体）1リュート。 </li><li>希釈された二次抗体溶液を添加し、45分間、暗室において室温でインキュベートします。 </li><li>希釈した二次溶液を除去し、1mlのPBSで3回、5分間ごとにiPS細胞を洗います。免疫蛍光顕微鏡下でiPS細胞を観察します。 </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

ここでは、OCT3 / 4、SOX2、KLF4、およびc-MYCは、4つの転写のセンダイウイルス媒介形質導入によりiPS細胞に黒色腫のTILを再プログラミングするためのプロトコルを要因を明らかにしました。このアプローチは、T細胞を再プログラムするためのSeVシステムを使用して、非組込み方法7の利点を提供します。 以前の研究では、センダイウイルスの再プログラミング・シス...

転写因子の定義されたセットの過剰発現を介して人工多能性幹細胞（iPS細胞）の生成を可能にする細胞再プログラミング技術は、細胞ベースの治療法1,2の分野において非常に有望です。これらのiPS細胞は、転写およびエピジェネティックな特徴を示すと同様に、胚性幹細胞（ESC）3-5の自己再生および多能性の能力を有します。過去10年間にリプログラミング技術で作られた著しい進歩は、私たちはあっても、このようなT細胞6-8のような分化細胞からヒトiPS細胞を生成することができました。 T細胞由来のiPS細胞（TiPSCs）はTiPSCs 9-11からの抗原特異的T細胞の再生を可能にする、元のT細胞などのT細胞受容体（TCR）鎖遺伝子の再配列と同じ構成を保持します。 患者の腫瘍から得られた黒色腫浸潤リンパ球（TILを）のほぼ80％は、具体的には、A、腫瘍関連抗原を認識するNDオリジナルの癌細胞12に対する細胞傷害性を維持します。注目すべきこと、のTILのプログラム細胞死タンパク質1（PD-1）の発現は、突然変異した新生抗原特異的CD8 +リンパ球13を含む自己腫瘍反応性レパートリーを同定することが見出されました。取リンパ球枯渇レジメンおよびインターロイキン2（IL-2）の全身投与と組み合わせてex vivoで拡大した自己のTILの養子移入は、患者14のサブセットに転移性メラノーマの実質的な後退を引き起こす可能性があります。前臨床モデルおよび患者に結果を励みにもかかわらず、貧しい注入されたT細胞の生存および免疫抑制経路の存在は、養子T細胞療法の可能性を最大限に妥協するように見えます。現在の臨床プロトコルは、多数を得るために、自己T細胞の大規模なex vivoでの操作を必要とします。これは、悪い生存率を有する最終分化T細胞の生成をもたらす、減少proliferative容量、およびPD-1 15の高レベル。 養子T細胞療法のこの制限は、理論的には、免疫療法のための自己T細胞の無制限の供給源を提供することができるiPS細胞を使用することによって克服することができます。我々は最近、センダイウイルス（SeVを）4転写因子の媒介形質導入、OCT3 / 4、SOX2、KLF4、およびc-MYC 16によるPD-1の高レベルで発現メラノーマのTILの再プログラミングを報告しています。レトロウイルスベクターは、再プログラミング遺伝子を発現するために宿主染色体への統合を必要とするが、センダイウイルスベクターは、非組み込みがあり、最終的に細胞質から排除されています。リプログラミング効率がレンチウイルスまたはレトロウイルスベクターを6-8と比較したSeVシステムとはるかに高いです。レンチウイルスまたはレトロウイルスベクターにより生成されるいくつかのIPSCのクローンは非リンパ系系列6-8由来することができるしながらさらに、センダイウイルスは、具体的には、末梢血単核細胞（PBMC）中のT細胞を再プログラムすることができます。ここでは、詳細手順は、ヒトメラノーマのTILの単離および活性化のためにとのSeVの再プログラミング・システムを使用してTIL由来のiPS細胞の生成のために実装されています。

<table><tbody><tr><td>gentle MACS C Tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>gentle MACS Dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>Tumor Dissociation Kit, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-929</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 70 um Cell Strainer</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 50ml Conical Cntrifuge tubes</td><td>BD</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Life technologies</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>human AB serum</td><td>Life technologies</td><td>34005100</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine (200mM)</td><td>Life technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol (1000x, 55mM)</td><td>Life technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>gentamicin</td><td>Life technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (-)</td><td>Life technologies</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>recombinant human (rh) IL-2</td><td>Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD3</td><td>BD</td><td>555329</td><td></td></tr><tr><td>Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28</td><td>BD</td><td>555725</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life technologies</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylcysteine</td><td>Cumberland Pharmaceuticals Inc.</td><td>NDC 66220-207-30</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tissue Culture Plates (6-well)</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tissue Culture Plates (24-well)</td><td>Corning</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Sendai virus vector</td><td>DNAVEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SNL feeder cells</td><td>Cell Biolabs, Inc</td><td>CBA-316</td><td></td></tr><tr><td>mitomycin C</td><td>SIGMA</td><td>M4287</td><td>soluble in water (0.5 mg/ml)</td></tr><tr><td>gelatin</td><td>SIGMA</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>basic fibroblast growth factor (bFGF)</td><td>Life technologies</td><td>PHG0264</td><td></td></tr></tbody></table>

generation of induced pluripotent stem cells from human melanoma tumor-infiltrating lymphocytes

ex vivoでの養子移入は、転移性黒色腫を有する患者のかなりの部分集合で、耐久性と完全な応答を媒介することができる自己腫瘍浸潤リンパ球（TILを）を拡大しました。このアプローチの主要な障害は、テロメアの短縮に起因する転送T細胞の減少生存率であり、のTILの限られた数の患者から得られました。長いテロメアを有するあまり分化T細胞は、養子T細胞療法のための理想的なT細胞のサブセットであろうが、これらのあまり分化T細胞を大量に生成することは問題があります。この養子T細胞療法の制限理論的にその自己複製人工多能性幹細胞（iPS細胞）を使用することによって克服することができる、多能性を維持するためには、テロメアの伸長、および免疫療法のための自己T細胞の無制限の供給源を提供しています。ここで、我々はのTILへの再プログラミング因子の伝達にセンダイウイルスベクターを用いてiPS細胞を生成するためのプロトコルを提示します。このプロトコルは、生成します完全に再プログラム、ベクトルフリーのクローンです。これらのTIL由来のiPS細胞は養子T細胞療法のためのあまり分化patient-および腫瘍特異的T細胞を生成することができるかもしれません。

図1は、抗CD3 / CD28による活性化とのTILにOCT3 / 4、KLF4、SOX2、およびc-MYCの遺伝子導入が続いているのrhIL-2と黒色腫のTILの初期膨張を伴う手順の概要を示していますiPS細胞の生成のため。通常、のrhIL-2開始と文化についてのTILは21-28日間培養開始後に球を形成しました。この時点で、のTILは、抗CD3 / CD28で活性化される準備ができていること、21日目のrhIL-2と文...

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Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.

ヒトメラノーマ腫瘍浸潤リンパ球から誘導多能性幹細胞の生成

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.7K ビュー.  University of Michigan. The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.

ビデオ: Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using patient-specific hiPSCs allows the study of the underlying mechanism for pathogenesis, also providing a platform for the development of in vitro drug screening and gene therapy to improve treatment options. The promising potential of hiPSCs for regenerative medicine is also evident from the increasing number of publications (>7000) on iPSCs in recent years. Various cell types from distinct lineages have been successfully used for hiPSC generation, including skin fibroblasts, hematopoietic cells and epidermal keratinocytes. While skin biopsies and blood collection are routinely performed in many labs as a source of somatic cells for the generation of hiPSCs, the collection and subsequent derivation of hair keratinocytes are less commonly used. Hair-derived keratinocytes represent a non-invasive approach to obtain cell samples from patients. Here we outline a simple non-invasive method for the derivation of keratinocytes from plucked hair. We also provide instructions for maintenance of keratinocytes and subsequent reprogramming to generate integration-free hiPSC using episomal vectors.

This manuscript provides a step-by-step procedure for the derivation and maintenance of human keratinocytes from plucked hair and subsequent generation of integration-free human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) by episomal vectors.

髪の由来ケラチノサイトを使用した統合フリーヒト誘導多能性幹細胞の生成

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

発生生物学

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.

This work describes an in vitro differentiation protocol to produce pigmented, mature melanocytes from human pluripotent stem cells via a neural crest and melanoblast intermediate stage using a feeder-free, 25 day protocol.

ヒト多能性幹細胞からメラノサイトのフィーダーフリーの導出

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a promising source for adoptive T cell therapy (ACT). However, classical in vitro methods for producing regenerated T cells from iPSC result in either innate-like or terminally differentiated T cells, which are phenotypically and functionally distinct from na&#239;ve T cells. Recently, a novel three-dimensional (3D) thymic culture system was developed to generate a homogenous subset of CD8&#945;&#946;+ antigen-specific T cells with a na&#239;ve T cell-like functional phenotype, including the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression in vivo. This protocol avoids aberrant developmental fates, allowing for the generation of clinically relevant iPSC-derived T cells, designated as iPSC-derived thymic emigrants (iTE), while also providing a potent tool to elucidate the subsequent functions necessary for T cell maturation after thymic selection.

This article describes a novel method to generate tumor antigen-specific induced pluripotent stem cell-derived thymic emigrants (iTE) by a three-dimensional (3D) thymic culture system. iTE are a homogenous subset of T cells closely related to na&#239;ve T cells with the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression.

マウス誘導多能性幹細胞由来腫瘍抗原特異的胸腺移民を生成する三次元胸腺培養システム

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

がん研究

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of malignancies 1. CTLs can recognize malignant cells by interacting tumor antigens with the T cell receptors (TCR), and release cytotoxins as well as cytokines to kill malignant cells. It is known that less-differentiated and central-memory-like (termed highly reactive) CTLs are the optimal population for ACT-based immunotherapy, because these CTLs have a high proliferative potential, are less prone to apoptosis than more differentiated cells and have a higher ability to respond to homeostatic cytokines 2-7. However, due to difficulties in obtaining a high number of such CTLs from patients, there is an urgent need to find a new approach to generate highly reactive Ag-specific CTLs for successful ACT-based therapies.
TCR transduction of the self-renewable stem cells for immune reconstitution has a therapeutic potential for the treatment of diseases 8-10. However, the approach to obtain embryonic stem cells (ESCs) from patients is not feasible. Although the use of hematopoietic stem cells (HSCs) for therapeutic purposes has been widely applied in clinic 11-13, HSCs have reduced differentiation and proliferative capacities, and HSCs are difficult to expand in in vitro cell culture 14-16. Recent iPS cell technology and the development of an in vitro system for gene delivery are capable of generating iPS cells from patients without any surgical approach. In addition, like ESCs, iPS cells possess indefinite proliferative capacity in vitro, and have been shown to differentiate into hematopoietic cells. Thus, iPS cells have greater potential to be used in ACT-based immunotherapy compared to ESCs or HSCs.
Here, we present methods for the generation of T lymphocytes from iPS cells in vitro, and in vivo programming of antigen-specific CTLs from iPS cells for promoting cancer immune surveillance. Stimulation in vitro with a Notch ligand drives T cell differentiation from iPS cells, and TCR gene transduction results in iPS cells differentiating into antigen-specific T cells in vivo, which prevents tumor growth. Thus, we demonstrate antigen-specific T cell differentiation from iPS cells. Our studies provide a potentially more efficient approach for generating antigen-specific CTLs for ACT-based therapies and facilitate the development of therapeutic strategies for diseases.

Generation of T lymphocytes from induced pluripotent stem (iPS) cells gives an alternative approach of using embryonic stem cells for T cell-based immunotherapy. The method shows that by utilizing either in vitro or in vivo induction system, iPS cells are able to differentiate into both conventional and antigen-specific T lymphocytes.

Tリンパ球に向かって誘導多能性幹細胞の分化の指示

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

免疫・感染学

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of patients with advanced cancer. Adoptive T cell transfer (ACT) of highly enriched tumor antigen-specific T cells has been shown to cause durable regression of metastatic cancer in some patients. However, during expansion, these cells may become exhausted or senescent, limiting their effector function and persistence in vivo. Induced pluripotent stem cell (iPSC) technology may overcome these obstacles by leading to in vitro generation of large numbers of less differentiated tumor antigen-specific T cells. Human iPSC (hiPSC) have the capacity to differentiate into any type of somatic cell, including lymphocytes, which retain the original T cell receptor (TCR) genomic rearrangement when a T cell is used as a starting cell. Therefore, reprogramming of human tumor antigen-specific T cells to hiPSC followed by redifferentiation to T cell lineage has the potential to produce rejuvenated tumor antigen-specific T cells. Described here is a method for generating tumor antigen-specific CD8&#945;&#946;+ single positive (SP) T cells from hiPSC using OP9/DLL1 co-culture system. This method is a powerful tool for in vitro T cell lineage generation and will facilitate the development of in vitro derived T cells for use in regenerative medicine and cell-based therapies.

This article describes a method to generate functional tumor antigen-specific induced pluripotent stem cell-derived CD8&#945;&#946;+ single positive T cells using OP9/DLL1 co-culture system.

腫瘍抗原特異的T細胞の生成にヒト誘導多能性幹細胞を用いた

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

CD133の患者由来の細胞培養および分離<sup&gt; +</supメラノーマから&gt;推定されるがん幹細胞

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

医学

Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts into Melanocytes

The loss of function of melanocytes leads to vitiligo, which seriously affects the physical and mental health of the affected individuals. Presently, there is no effective long-term treatment for vitiligo. Therefore, it is imperative to develop a convenient and effective treatment for vitiligo. Regenerative medicine technology for direct reprogramming of skin cells into melanocytes seems to be a promising novel treatment of vitiligo. This involves the direct reprogramming of the patient's skin cells into functional melanocytes to help ameliorate the loss of melanocytes in patients with vitiligo. However, this method needs to be first tested on mice. Although direct reprogramming is widely used, there is no clear protocol for direct reprogramming into melanocytes. Moreover, the number of available transcription factors is overwhelming. 
Here, a concentrated lentivirus packaging system protocol is presented to produce transcription factors selected for reprogramming skin cells to melanocytes, including Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9, and Snai2. Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were infected with the concentrated lentivirus for all these transcription factors for the direct reprogramming of the MEFs into induced melanocytes (iMels) in vitro. Furthermore, these transcription factors were screened, and the system was optimized for direct reprogramming to melanocytes. The expression of the characteristic markers of melanin in iMels at the gene or protein level was significantly increased. These results suggest that direct reprogramming of fibroblasts to melanocytes could be a successful new therapeutic strategy for vitiligo and confirm the mechanism of melanocyte development, which will provide the basis for further direct reprogramming of fibroblasts into melanocytes in vivo.

Here, we describe an optimized direct reprogramming system for melanocytes and a high-efficiency, concentrated virus packaging system that ensures smooth direct reprogramming.

マウス線維芽細胞のメラノサイトへの直接リプログラミング

The loss of function of melanocytes leads to vitiligo, which seriously affects the physical and mental health of the affected individuals. Presently, ...

<meta charset="utf8"></head><body>患者由来の黒色腫オルガノイド:がん免疫療法の最前線

Unveiling Therapeutic Opportunities with Melanoma Patient-derived Organoid Models

With the development of immunotherapy, there is an ongoing need to develop models that can recapitulate the tumor microenvironment of native tumors. While traditional two- and three-dimensional models can offer insights into cancer development and progression, these lack crucial aspects that hinder a faithful mimic of native tumors. An alternative model that has gained a lot of attention is the patient-derived organoid. The development of these organoids recapitulates the complex intercellular communication, tumor microenvironment, and histoarchitecture of tumors. This paper describes the protocol for establishing melanoma patient-derived organoid (MPDO) models. To validate these models, we assessed the immune cell composition, including the expression levels of T-cell activation markers, to confirm the cellular heterogeneity of the organoids. Additionally, to describe the potential utility of MPDOs in cellular therapies, we evaluated the cytotoxic capabilities of treating the organoids with &#947;&#948; T-cells. In conclusion, the MPDO models offer promising avenues for understanding tumor complexity, validating therapeutic strategies, and potentially advancing personalized treatment.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:免疫療法評価のための患者由来オルガノイドによる黒色腫の複雑さの再現

Here, we present a protocol to generate melanoma patient-derived organoids by culturing disassociated cell suspensions from fresh melanoma tissues. These organoids faithfully recapitulate patient-specific tumors in vitro, offering an innovative approach to exploring tumor immunosuppressive mechanisms, drug screening, drug resistance mechanisms, and cancer surveillance approaches.

メラノーマ患者由来オルガノイドモデルによる治療機会の解明

With the development of immunotherapy, there is an ongoing need to develop models that can recapitulate the tumor microenvironment of native tumors. While ...

ヒトメラノーマ腫瘍浸潤リンパ球から誘導多能性幹細胞の生成

要約

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髪の由来ケラチノサイトを使用した統合フリーヒト誘導多能性幹細胞の生成

ヒト多能性幹細胞からメラノサイトのフィーダーフリーの導出

マウス誘導多能性幹細胞由来腫瘍抗原特異的胸腺移民を生成する三次元胸腺培養システム

Tリンパ球に向かって誘導多能性幹細胞の分化の指示

腫瘍抗原特異的T細胞の生成にヒト誘導多能性幹細胞を用いた

CD133の患者由来の細胞培養および分離

マウス線維芽細胞のメラノサイトへの直接リプログラミング

メラノーマ患者由来オルガノイドモデルによる治療機会の解明

メラノーマ患者由来オルガノイドモデルによる治療機会の解明

メラノーマ患者由来オルガノイドモデルによる治療機会の解明