この方法は、標的免疫調節のための腫瘍分解ベクターの開発を促進することにより、がん免疫療法の分野における主要な課題に対処するのに役立ちます。応用リバース遺伝系の主な利点は、その汎用性;したがって、ベクターは、多様な免疫シグネチャを有する様々な研究の質問や標的腫瘍に対処するために適応させることができる。ウイルス伝播のステップは、特にウイルスを収穫するための最適なタイムポイントを決定することは、時間の経過とともに同期形成を視覚的に評価しなければならないため、テキストプロトコルから学ぶのは困難である。
原稿に記載されているように組換え免疫調節ベクターの設計およびクローンを開始する。このプロトコルは、二重特異性T細胞エンゲージをコードする、発疹ワクチンベクターの開発のための具体的なステップを記述する。cDNAから麻疹ウイルスを救出するために、トランスフェクションプレートの24時間前に、トランスフェクションプレートは麻疹ウイルス産生細胞を6つの壁板に均等にする。
種子200,000細胞は、トランスフェクション時に65〜75%の合流を達成するために、1ウェルあたり10%FBSを含有する2ミリリットルDMEMで。細胞をトランスフェクトするために使用される麻疹ウイルス抗ゲノムをコードする組み換えDNAの5マイクログラムを混合する。DMEMの200マイクロリットルの総容積の適切なプラスミドおよび蛍光レポーター。
18.6マイクロリットルのリポソームトランスフェクション試薬を混合物に加え、すぐにチューブをフリックして混合します。このトランスフェクションミックスを室温で25分間インキュベートします。MVプロデューサー細胞をトランスフェクトするには、65〜75%の合流度に成長した6ウェルプレートから培地を取り除き、1ウェルあたり2%FBSと50マイクログラムあたり50マイクログラムのDMEMを1.8ミリリットル加える。
その後、トランスフェクションミックスを各ウェルに滴下し、慎重に旋回します。細胞を摂氏37度と二酸化炭素5%で一晩インキュベートする。翌日、培地を2%FBS、1ミリリットルカナマイシン当たり50マイクログラムの新鮮なDMEMで培地を交換し、黄色の色で酸性になった場合にこれを繰り返します。
顕微鏡を使用して、レポーター遺伝子発現およびシンクリシア形成のために細胞を毎日観察する。20以上の細胞からなる大きな同期が目に見える場合、または細胞があまりにも密になったときにウイルスを収穫。予想される収穫シードの24時間前に、ウイルス接種時に65〜75%の合流を達成するために、10センチメートルの皿に10%FBSを有するDMEMの12ミリリットルの約150万のMV生産者細胞。
ウイルスを収集するには、細胞スクレーパーを使用して、トランスフェクトされた細胞と6つの壁プレートから接着プロデューサー細胞を慎重にスクレイピングします。掻き取った細胞を含む培地を遠心管に移します。遠心分離機は、少なくとも2500倍Gと5分間摂氏4度の細胞の破片を除去するために。
遠心分離後、無細胞上清と無血清培地を4ミリリットルの最終体積に混合し、接種を調製する。MVプロデューサー細胞を持つ10センチメートル皿から培地を取り除き、細胞に接種を加えます。摂氏37度と5%の二酸化炭素で少なくとも2時間インキュベートする。
インキュベーション後、10%FBSで6ミリリットルのDMEMを加え、細胞を一晩インキュベートします。その後、培地を12ミリリットルの新鮮なDMEMを10%FBSに置き換え、収穫まで摂氏37度と5%の二酸化炭素でインキュベートします。細胞を少なくとも1日2回観察してください。
膜の破壊が目に見えるウイルスの収穫になると、同期バーストの前に.第1の通路を収穫するためにプレートから上澄み物を取り除き、600マイクロリットルの無血清培地を添加する。その後、セルリフターを使用して細胞を削り、きれいなチューブに移します。
その直後にウイルス懸濁液を液体窒素で凍結し、完全凍結を確実にするために少なくとも24時間摂氏80度で保存します。96の壁板を使用してアリコート当たりの八重奏でウイルスストックの価数を決定する。まず、T75細胞培養フラスコから50ミリリットル円錐形チューブにプロデューサー細胞を引き出します。
セルを数え、10%FBSでDMEMで1ミリリットル当たり150,000細胞に細胞懸濁液を調整します。96の壁板の井戸ごとに10パーセントFBSのDMEMの90マイクロリットルを加える。次に、ウイルスストックの1つのアリコートからプレートの最初の列のすべての8つの井戸に10マイクロリットルを加えます。
少なくとも10回は上下にピペットを入れ、十分に混ぜます。マルチチャンネルピペットを使用して、1番目から2番目の列まで各井戸の10マイクロリットルを転送し、上下にピペットを入れ込んで十分に混ぜます。各カラムでこれを繰り返し、希釈工程ごとに新鮮なピペットチップを使用してウイルスの連続10倍希釈を得る。
最後の列の各ウェルから10マイクロリットルを捨てます。150,000個の細胞を1ミリリットルあたり100マイクロリットルの細胞懸濁液に加え、細胞塊がないことを確認します。摂氏37度、炭酸ガス5%を48時間インキュベートします。
光顕微鏡を使用して同期性を確認します。可視の同期を含む最も高い希釈係数を持つ列の各ウェルの同期をカウントします。蛍光レポーターをコードするウイルスの場合、蛍光顕微鏡を用いて同期を数えることができる。
感染の1日前に、100,000個のベロ細胞をDMEMの1ミリリットルで、12個の壁面プレートに12個のウェルを有する12個の壁面プレートで、100,000個のベロ細胞を感染させる前日に、麻疹ウイルス複製動態を分析した。細胞に感染するために、ウイルスのそれぞれの量を含む血清遊離培地の300マイクロリットルで培地を交換する。摂氏37度、二酸化炭素5%を少なくとも2時間インキュベートする。
接種を取り除き、10%FBSでDMEMを1ミリリットル加え、インキュベーションを続けます。感染後の関連ポイントでは、直接培地に細胞を掻き取ることによってウイルス原生を収穫する。各ウェルから個々のチューブに内容を移します。
液体窒素で凍結し、滴定するまで摂氏80度で保存し、原稿に記載されているように進みます。LDH放出によるBTE誘導細胞媒介細胞傷害性の評価を開始するために、まず、ウイルス感染標的細胞によって発現される分泌されたトランスジーン産物を単離し、原稿に記載される免疫エフェクター細胞を単離する。次に、U-底96壁板に標的細胞をシードし、原稿に記載されているサンプルを含む。
必要な濃度で、事前に単離された免疫調節剤をそれぞれのサンプルに加えます。所望の比率で免疫脱北細胞を加え、ウェルあたり100マイクロリットルの総体積に培地を加える。摂氏37度と5%の二酸化炭素で、以前に決定された必要な時間枠をインキュベートします。
サンプル採取の45分前に、T maxサンプルと対応する培地コントロールを含むウェルに10マイクロリットルの10マイクロリットルの10X Lysis溶液を加え、インキュベーションを継続します。細胞をGの250倍で4分間遠心分離する。細胞を移さないように平らな底96の壁の版の井戸に各井戸から上澄みの50マイクロリットルを移す。
メーカーに従って基板溶液を調製した後、各ウェルに50マイクロリットルを追加します。暗闇の中で室温で30分間、またはT maxサンプルが深い赤になるまでインキュベートします。インキュベーション後、各ウェルに50マイクロリットルのストップ溶液を加えます。
遠心分離機はGの4000倍で1分間、そしてくぼんだ針を使って気泡を取り除く。490ナノメートルで光学吸光度を測定し、原稿に記載されているように計算します。未修飾およびBTEコードの加血性麻疹を用いた接種後、ベロ細胞上の比較されたベクターの成長曲線は類似しているように見える。
mc38マウス大腸癌細胞上の細胞生存曲線は、ヒト発がん性胎児性抗原およびMV受容体CD46を接種後安定に発現し、トランスジーンをコードするウイルスのリンパ管細胞株におけるリンパ管のリンパ動のリンパ活性が遅れていることを示している。BTEと共にインキュベートした標的抗原発現細胞のフローサイトメトリーは、濃度依存的に細胞によってBTE結合を示した。BTE関連細胞の磁気プルダウン後のイムノブロットでは、非標的BTEが使用された場合には検出可能な量の細胞が存在しなかったのに対し、BTEサンプルを標的とした場合は結合細胞が溶出画画に存在していたことが示された。
BTE媒介標的抗原特異的および濃度依存性マウスT細胞の細胞毒性は、代表的なLDH放出アッセイによって示され、本実施例では、参照細胞と比較して1ミリリットル当たり1マイクログラムの比較的高いBTE濃度で特異的細胞殺死が達成されたことを示している。この手順を試みる間、 定期的に感染の進行を確認する細胞を監視することを忘れないでください。組み換え麻疹ワクチン株は、減衰したが、特に免疫抑制された個人に有害であるかもしれないことを忘れないでください。
適切なバイオ安全手順に従って、暴露を避けてください。ウイルスを扱う個人は、これらの方法を実行する前に予防接種を受ける必要があります。この手順に従って、さらにトランス遺伝子のウイルス発現は、ウイルス宿主の相互作用および治療効果を分析するために達成され得る。
これらの技術の開発は、バイオセラピーの分野の研究者が、多数の腫瘍性エンティティにおける局所的に発現した免疫調節物質の効果を探求する道を開いた。
