このプロトコルは、比較的迅速でコスト効率の高い方法、および自動取得および分析を提供するため、一般的なエピジェネティックバイオマーカーである5-メチルシトシンの低感度スクリーニングを実現します。この手法の主な利点は、ユーザーがモデルと開発段階に合わせて最適化できる実験計画を提供する柔軟性です。この手法は、化学物質への曝露が、通常はシーケンシングなどの高価な高trpA法によってのみ行うことができる、発生中の生物内の5-メチルシトシンの相対的な存在量をどのように変化させるかを検出するために使用できます。
この方法は、環境刺激に応答する5-メチルシトシンのエピジェネティックな変化を理解するためにNCG法を利用することを目指すあらゆる研究に役立ちます。収集の朝に新しい露出溶液を準備することから始めます。5ミリリットルの粒子状物質を含まないシステム水を60ミリメートルのガラスペトリ皿に加えます。
次に、10マイクロリットルのマイクロキャピラリーガラスピペットを使用して、10マイクロリットルのジメチルスルホキシドまたは化学ストック溶液をシステム水に移します。ガラスのペトリ皿を回転させて、原液が確実に消散します。ガラスのペトリ皿にさらに5ミリリットルのシステム水を加え、皿を回転させて露光溶液を均質化します。
蒸発を最小限に抑えるために、ガラス皿にガラス蓋をします。次に、RO水で満たされた噴出ボトルを使用して、胚を魚網から100ミリメートルの皿に移します。受精後0.75時間で50個の生胚をランダムに分類し、余分なRO水を取り除きます。
暴露期間が終了したら、インキュベーターから胚を取り出します。すべての生きている胚を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。胚を吸引せずに残留暴露溶液を吸引する。
500マイクロリットルの冷やした4%パラホルムアルデヒドを加え、胚を数回反転させて混合します。胚を固定し、摂氏4度で一晩4%パラホルムアルデヒドを固定します。胚を固定した後、4%パラホルムアルデヒドを吸引し、胚を1X PBSに再消化し、30秒間穏やかなピペッティングによって混合する。
ガラスピペットを使用して、固定胚をRO水で満たされたガラス皿に注意深く移します。30秒間ゆっくりと回転させ、この洗浄を1回繰り返します。倍率5倍に設定した実体顕微鏡下で、注射針を用いて胚を脱コレーションする。
針先を使用して、絨毛膜に穴を開け、卵黄と細胞塊からそっと剥がします。胚がデコレニングされたら、ガラスマイクロキャピラリーピペットを使用して、最大25個の無傷の胚を1つの免疫組織化学バスケットに移します。IHCバスケットを24ウェルプレートに入れます。
次に、各井戸から水を吸引します。ウェルあたり500マイクロリットルのブロッキングバッファーに胚を再懸濁し、プレートをパラフォームとアルミホイルで包み、光から保護します。プレートを摂氏4度で100rpmのオービタルシェーカーで4時間インキュベートします。
インキュベーション後、各ウェルからブロッキングバッファーを吸引します。500マイクロリットルの一次抗体溶液と交換してください。バックグラウンドノイズを説明するために、ブロッキングバッファーを使用してビヒクルコントロール胚のサブセットをインキュベートすることを忘れないでください。
プレートとパラフォームとアルミホイルを再ラップし、プレートをオービタルシェーカーで摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、各ウェルから一次抗体溶液を取り出し、1x PBSTと交換します。各ウェルを1x PBSTで3回、オービタルシェーカーで1回の洗浄で5分間洗浄します。
各ウェルから1x PBSTを吸引し、IHCバスケットをRO水で満たされたガラスのペトリ皿に入れます。標準的な実体顕微鏡下で、無傷の胚をランダムに96ウェルプレートに分類し、ウェルごとに1つの胚を確保します。次に、個々の井戸からすべてのRO水を取り除き、200マイクロリットルの1x PBSを追加します。
プレートを1Gで3分間遠心分離し、透過光とFITCの下で2倍の対物レンズで胚を画像化します。オートフォーカスを選択して、カメラの焦点がプレートの下部にあり、下部の厚さによってオフセットされていることを確認します。露光時間が100ミリ秒のFITC波長を選択し、オートフォーカスをZオフセットのレーザーに設定します。
プレート取得を開始する前に、適切な画像取得といくつかのウェルを観察して確認してください。画像取得後、ハイコンテントスクリーニングシステムとカスタム自動画像解析手順を使用してデータ解析を実行します。蛍光の総面積および積分強度について分析する96ウェルプレート上の各胚を選択する。
次に、データポイントを集計し、測定に移動してオープンデータログを選択してデータをスプレッドシートにエクスポートすることにより、ハイコンテントスクリーニングシステムからエクスポートします。エクスポートしたスプレッドシートをデプロイヤーパッケージにアップロードして、各ウェルのデータを並べ替えて合計し、ウェル番号でフィルタリングします。次に、適切なExcelパッケージを使用して、合計データをスプレッドシートにエクスポートします。
5-メチルシトシン特異的総面積の分布と積分強度は、受精後6時間でゼブラフィッシュ胚について評価されました。X 軸は、車両としての DMSO またはポジティブ コントロールとしての TDCIPP への曝露を示します。Y軸は相対蛍光を示す。
閾値は、胚内で検出された5-メチルシトシンの総面積と、最大シグナル対ノイズ比を示す同じ領域内の積分強度によって示されるように、ビヒクル処理された胚とは有意に異なっていました。IHCを適切に検出するためには、ヨークと細胞塊の完全性を維持することが非常に重要です。この方法は比較的鈍感ではなく、相対的な存在量のRFUデータのみを提供します。
定量化が必要な場合は、よりターゲットを絞ったアプローチでフォローアップできます。
