Este protocolo oferece um método relativamente rápido e econômico, bem como uma aquisição e análise automatizadas, produzindo assim triagem de baixa sensibilidade da 5-metilcitosina, que é um biomarcador epigenético comum. A principal vantagem desta técnica está na flexibilidade que oferece um design experimental que os usuários podem otimizar para o seu modelo e estágio de desenvolvimento. Esta técnica pode ser usada para detectar como a exposição química altera a abundância relativa de 5-metilcitosina dentro de um organismo em desenvolvimento, o que normalmente só poderia ser feito através de métodos caros de alta trpA, como o sequenciamento.
Este método é útil para qualquer pesquisa que vise utilizar métodos NCG para entender as alterações epigenéticas da 5-metilcitosina em resposta a estímulos ambientais. Comece por preparar uma solução de exposição fresca na manhã da recolha. Adicione cinco mililitros de água livre de partículas a uma placa de Petri de vidro de 60 milímetros.
Em seguida, use uma pipeta de vidro microcapilar micro de 10 microlitros para transferir 10 microlitros de sulfóxido de dimetilo ou solução de estoque químico para a água do sistema. Gire a placa de Petri de vidro para garantir que a solução de estoque se dissipe. Adicione mais cinco mililitros de água do sistema à placa de Petri de vidro e gire o prato para homogeneizar a solução de exposição.
Cubra os pratos de vidro com tampas de vidro para minimizar a evaporação. Em seguida, use uma garrafa de esguicho cheia de água RO para transferir os embriões da rede de peixe para um prato de 100 milímetros. Classifique aleatoriamente 50 embriões vivos em 0,75 horas após a fertilização e remova o excesso de água RO.
Após o término da duração da exposição, remova os embriões da incubadora. Transfira todos os embriões vivos para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Aspirar solução de exposição residual sem aspirar embriões.
Adicione 500 microlitros de paraformaldeído a 4% refrigerado e misture os embriões por inversão várias vezes. Deixe os embriões fixarem e 4% paraformaldeído durante a noite a quatro graus Celsius. Após a fixação dos embriões, aspirar o paraformaldeído a 4%, regastar os embriões em 1X PBS e misturar por pipetagem suave por 30 segundos.
Usando uma pipeta de vidro, transfira cuidadosamente embriões fixos para um prato de vidro cheio de água RO. Gire suavemente por 30 segundos e repita esta lavagem uma vez. Sob um microscópio estéreo definido em cinco vezes ampliação decorar os embriões usando agulhas de seringa.
Usando a ponta da agulha, perfure o córion e descasque-o suavemente da gema e da massa celular. Depois que os embriões tiverem sido decorados, use uma pipeta microcapilar de vidro para transferir até 25 embriões intactos para uma cesta de imuno-histoquímica. Coloque a cesta IHC em uma placa de 24 poços.
Em seguida, aspirar a água de cada poço. Ressuscite os embriões em 500 microlitros de tampão de bloqueio por poço, envolva a placa com paraforma e folha de alumínio para protegê-la da luz. Incubar a placa a quatro graus Celsius durante quatro horas num agitador orbital a 100 rpm.
Após a incubação, aspirar o tampão de bloqueio de cada poço. Substitua-o por 500 microlitros de solução de anticorpos primários. Lembre-se de incubar um subconjunto de embriões de controle de veículos com o buffer de bloqueio para explicar o ruído de fundo.
Reembrulhe a placa e a paraforma e a folha de alumínio e permita que a placa incube a quatro graus Celsius durante a noite em um agitador orbital. No dia seguinte, remova a solução primária de anticorpos de cada poço e substitua-a por 1x PBST. Lave cada poço três vezes com 1x PBST por cinco minutos por lavagem em um agitador orbital.
Aspirar 1x PBST de cada poço e colocar a cesta IHC em uma placa de Petri de vidro cheia de água RO. Sob um microscópio estéreo padrão, classifique aleatoriamente embriões intactos em uma placa de 96 poços, garantindo um embrião por poço. Em seguida, remova toda a água RO de poços individuais e adicione 200 microlitros de 1x PBS.
Centrifugar a placa por três minutos em um G.Image os embriões com uma objetiva duas vezes sob luz transmitida e FITC. Selecione o foco automático para garantir que o foco da câmera esteja na parte inferior da placa e seja deslocado pela espessura inferior. Selecione um comprimento de onda FITC com uma duração de exposição de 100 milissegundos e defina o foco automático para laser com um deslocamento Z.
Observe e confirme a aquisição adequada de imagens e vários poços antes de iniciar a aquisição da placa. Após a aquisição da imagem, realize a análise dos dados usando o sistema de triagem de alto conteúdo e um procedimento personalizado de análise automatizada de imagens. Selecione cada embrião na placa de 96 poços a ser analisado quanto à área total e intensidade integrada de fluorescência.
Em seguida, tabular os pontos de dados e exportá-los do sistema de triagem de alto conteúdo, indo para medir e selecionando o log de dados aberto para exportar os dados para uma planilha. Carregue a planilha exportada para o pacote do implantador para classificar e somar dados para cada poço e filtrar por número de poço. Em seguida, use o pacote do Excel correto para exportar os dados somados para uma planilha.
A distribuição e a intensidade integrada da área total específica de 5-metilcitosina foram avaliadas para embriões de peixe-zebra em seis horas após a fertilização. O eixo x mostra a exposição ao DMSO como veículo ou ao TDCIPP como controle positivo. O eixo Y denota fluorescência relativa.
Os limiares foram significativamente diferentes dos embriões tratados com veículo, como demonstrado pela área total de 5-metilcitosina detectada nos embriões e pela intensidade integrada dentro dessa mesma área, indicando a relação sinal/ruído máxima. É extremamente importante manter a integridade do jugo e da massa celular para a detecção adequada da IHC. Este método é relativamente insensível e oferece apenas dados RFU de abundância relativa.
Se a quantificação for necessária, pode-se seguir com uma abordagem mais direcionada.
