该协议提供了一种相对快速且具有成本效益的方法，以及自动采集和分析，从而产生5-甲基胞嘧啶的低灵敏度筛选，这是一种常见的表观遗传生物标志物。该技术的主要优点在于它提供了实验设计的灵活性，用户可以根据其模型和开发阶段进行优化。该技术可用于检测化学暴露如何改变发育中生物体内5-甲基胞嘧啶的相对丰度，这通常只能通过昂贵的高trpA方法（如测序）来完成。
该方法对于任何旨在利用NCG方法了解5-甲基胞嘧啶响应环境刺激的表观遗传改变的研究都是有用的。首先在收集的早晨准备新鲜的暴露溶液。将五毫升无颗粒系统水加入 60 毫米玻璃培养皿中。
然后使用10微升微毛细管玻璃移液器将10微升二甲基亚砜或化学储备溶液转移到系统水中。旋转玻璃培养皿以确保储备溶液消散。向玻璃培养皿中再加入五毫升系统水，并旋转培养皿以使暴露溶液均质化。
用玻璃盖盖住玻璃盘，以尽量减少蒸发。接下来，使用充满RO水的喷瓶将胚胎从鱼网转移到100毫米的培养皿中。在受精后 50 小时随机分选 0.75 个活胚胎并去除多余的 RO 水。
暴露持续时间结束后，从培养箱中取出胚胎。将所有活胚胎转移到1.5毫升微量离心管中。吸出残留暴露溶液而不吸出任何胚胎。
加入500微升冷藏的4%多聚甲醛，并通过倒置几次混合胚胎。让胚胎固定并在 4 摄氏度下将 4% 多聚甲醛过夜。固定胚胎后吸出4%多聚甲醛，将胚胎重新花费在1X PBS中，并通过轻轻移液混合30秒。
使用玻璃移液管，小心地将固定胚胎转移到充满RO水的玻璃培养皿中。轻轻旋转 30 秒，然后重复洗涤一次。在设置为五倍放大倍率的体视显微镜下，使用注射器针头对胚胎进行刻膜处理。
使用针尖刺穿绒毛膜，轻轻地将其从蛋黄和细胞块上剥离。胚胎脱模后，使用玻璃微毛细管移液器将多达25个完整的胚胎转移到一个免疫组织化学篮中。将IHC篮放入24孔板中。
然后从每口井中吸出水。将胚胎重悬于每孔500微升的封闭缓冲液中，用副形和铝箔包裹板以保护其免受光照。将板在 4 摄氏度下以 100 rpm 的速度在轨道振荡器上孵育四小时。
孵育后，从每个孔中吸出封闭缓冲液。用500微升一抗溶液代替。请记住用封闭缓冲液孵育一部分载体对照胚胎，以考虑背景噪音。
重新包裹板和副成型和铝箔，让板在轨道摇床上在四摄氏度下孵育过夜。第二天从每个孔中取出一抗溶液，并用1x PBST替换。在轨道摇床上用 1x PBST 洗涤每个孔三次，每次洗涤 5 分钟。
从每个孔中吸出1x PBST，并将IHC篮子放入装有RO水的玻璃培养皿中。在标准体视显微镜下，将完整的胚胎随机分类到96孔板中，确保每孔一个胚胎。然后从单个井中取出所有RO水，并加入200微升1x PBS。
在一个G.Image下用两倍物镜在透射光和FITC下离心板三分钟。选择自动对焦以确保相机的焦点位于板的底部并偏移底部厚度。选择曝光持续时间为 100 毫秒的 FITC 波长，并将自动对焦设置为具有 Z 偏移的激光。
在开始板采集之前，观察并确认正确的图像采集和几个孔。图像采集后，使用高内涵筛选系统和定制的自动图像分析程序进行数据分析。选择96孔板上的每个胚胎，以分析荧光的总面积和综合强度。
然后将数据点制成表格，并通过“测量”并选择“打开数据日志”将数据导出到电子表格，从而将数据从高内涵筛选系统中导出。将导出的电子表格上传到部署程序包，以对每个孔的数据进行排序和汇总，并按孔数进行筛选。然后使用正确的 Excel 包将汇总的数据导出到电子表格中。
在受精后6小时评估斑马鱼胚胎的5-甲基胞嘧啶特异性总面积的分布和综合强度。x轴显示DMSO作为载体或TDCIPP作为阳性对照的暴露。Y 轴表示相对荧光。
阈值与载体处理的胚胎显着不同，如胚胎内检测到的5-甲基胞嘧啶的总面积和同一区域内的积分强度所示，表明最大信噪比。保持轭和细胞团的完整性对于正确的IHC检测非常重要。这种方法相对不敏感，仅提供相对丰度的RFU数据。
如果需要量化，可以采取更有针对性的方法。
