がん治療の深刻な障害は、生理学的障壁のために、より深い腫瘍細胞への治療薬のアクセスが制限されていることです。従って、薬物送達効率を高めるために生物学的障壁を処理することができる新規分子トランスポーターの開発が強く望まれている。この手順の目的は、細胞間浸透を強化するための環状細胞透過性ペプチドを合成することです。
この方法の利点は、金属触媒を必要とせずに、システインおよび樹脂との置換反応によってペプチド環化を容易に達成できることである。芳香族架橋の組み込みは、親水性ラクタムまたはトリアゾール架橋と比較してペプチドの全体的な疎水性を改善し、それによってそれらの透過性を高める。まず、手動ペプチド合成装置をヒュームフードに組み立てます。
三方活栓を真空マニホールドに置き、窒素に接続します。未使用の入口には必ずキャップをしてください。10ミリリットルのポリプロピレンカラムを三方活栓に取り付け、ゴム製ピペットバルブまたは廃棄物トラップを介した真空を使用して、ポリプロピレンカラムから反応混合物または溶媒を排出します。
ペプチド合成用の樹脂を調製するには、必要量の樹脂に4〜5ミリリットルのDMFを加え、30分間穏やかに窒素バブリングしながらポリプロピレンカラムに移して樹脂を適切に膨潤させます。DMFを排出し、4〜5ミリリットルの50%モルホリン/ DMFを樹脂に加えます。窒素を30分間穏やかにバブリングしてN末端Fmoc基を除去し、混合物を排出します。
4〜5ミリリットルのDMFをカラムに加え、毎回少なくとも1分間窒素でバブリングすることにより、樹脂を3回徹底的に洗浄します。同様に、樹脂をジクロロメタンで3回、DMFで3回洗浄します。次に、648.8ミリグラムのFmocおよびPBF保護アルギニンと372.6ミリグラムのHATUを5ミリリットルのDMFに遠沈管に溶解します。
348.4マイクロリットルのDIPEAを加えてカップリング反応を活性化し、反応混合物を樹脂とともにポリプロピレンカラムに移します。窒素バブリングで混合物を1〜2時間穏やかに攪拌し、カップリング反応を1回繰り返します。反応混合物を排出し、DMF、ジクロロメタン、および再びDMFで各回少なくとも1分間、それぞれ3回ずつ樹脂を順次洗浄します。
Fmoc保護基を除去し、前に示した手順に従って樹脂を洗浄してから、次のアミノ酸を結合します。次に、アミノ酸カップリングと同じプロセスを使用して、FITC標識のスペーサーとしてβ-アラニンを結合し、次に、暗所でポリプロピレンカラムにFITC、DIPEA、およびDMFの混合物を添加して、樹脂上のペプチドのFITC標識を実行します。反応にはほぼ8時間かかります。
直鎖状ペプチドの環化を行うには、トリフルオロ酢酸、トリイソプロピルシラン、ジクロロメタンの混合物をポリプロピレンカラムに2分間加え、システインのトリチル保護基を選択的に除去します。混合物を排出し、黄色がかった溶液が無色になるまで手順を繰り返して、トリチル保護基を完全に除去します。DMFとジクロロメタンで樹脂を少なくとも3回連続洗浄し、DIPEAでDMFに4,4'-ビスブロモメチル-ビフェニルを溶解します。
溶液をカラムに加え、4時間反応させる。樹脂を4〜5ミリリットルのメタノールでそれぞれ5分間2回洗浄し、窒素を連続的に流して乾燥させます。システインを含むペプチドの場合は、トリフルオロ酢酸、トリイソプロピルシラン、および水またはトリフルオロ酢酸、トリイソプロピルシラン、1,2-エタンジチオール、および水の効果的な切断カクテルで樹脂を処理します。
ペプチド結合樹脂を2〜3時間処理してペプチドを切断し、次に窒素流でトリフルオロ酢酸を注意深く除去します。粗ペプチドを得るには、切断されたペプチド調製物に4〜5ミリリットルのジエチルエーテルを加えて粗ペプチドを沈殿させ、10, 000 x gで4分間遠心分離します。上清を注意深く廃棄し、効果的なヒュームフードでペプチドを3分間風乾します。
小規模粗ペプチドを800マイクロリットルのアセトニトリルに溶解し、逆相高速液体クロマトグラフィーおよび液体クロマトグラフィー質量分析を使用して分析します。組織培養プレートインサートを備えた12ウェルチャンバー内の2ミリリットルのDMEMに100, 000個のHeLa細胞を接種し、5%二酸化炭素を含む摂氏37度の加湿インキュベーターで24時間インキュベートします。培地を取り出し、チャンバー内の細胞を1ミリリットルの10マイクロモルのFITC-R8またはFITC-sR8-4のFBSフリーDMEM中で1時間インキュベートします。
その後、ペプチドを含む培地を取り除き、1ミリリットルのPBSで細胞を3回洗浄します。1ミリリットルの新鮮なFBSフリーDMEMをチャンバーに加え、チャンバー内のHeLa細胞を組織培養プレートインサートと共インキュベートし、HeLa細胞を下部の丸いカバーガラスに2時間入れます。丸いカバーガラス上のHeLa細胞を2.5%グルタルアルデヒドで15分間固定し、次にDAPIで15分間細胞を染色します。
最後に、カバーガラス上のHeLa細胞を蛍光顕微鏡で観察します。FITC標識直鎖状R8ペプチドおよびFITC標識ステープルR8ペプチドの合成の概略図をここに提示する。直鎖状R8ペプチドおよびステープルR8ペプチドのHPLCおよびMSスペクトルをこの図に示します。
ステープルペプチドの保持時間は、直鎖類似体のそれよりも実質的に長く、疎水性架橋による環化後のペプチドの全体的な疎水性の増強を示した。このグラフィック画像は、25%FBSの存在下での直鎖状ペプチドおよびステープルペプチドの安定性を表す。環状R8は、FBSと4時間インキュベートした後も77.3%のインタクトのままであるが、その直鎖状対応物はほとんど分解されており、環状R8ペプチドのタンパク質分解安定性が向上していることを示唆している。
3マイクロモルFITC標識直鎖状R8ペプチドおよびFITC標識ステープルR8ペプチドとの1時間インキュベーション後のHeLa細胞および4T1細胞の生細胞蛍光顕微鏡画像をここに示します。環状R8で芳香族架橋で処理した細胞は、直鎖状に処理した細胞よりも高い細胞内蛍光を示したことがわかります。フローサイトメトリー解析でも同様の結果が得られました。
環状R8が細胞間浸透の増強をもたらすかどうかをさらに調査するために、トランスウェルモデルを使用して、ある細胞層から別の細胞層へのペプチドのバリア透過性をシミュレートしました。環状R8は、細胞内蛍光の有意な増加によって示されるように、直鎖状R8ペプチドよりも明らかに高いトランスバリア透過性を示した。システインと樹脂のトリチル基の完全な脱保護は、次の環化工程にとって重要である。
さらに、環化効率は、立体効果により、ペプチドの特定の配列と長さにも依存します。このような場合、溶液相で希薄濃度でペプチドをより低い負荷容量または環化を有する樹脂を使用することが有用であろう。これらの環状ペプチドは、それらの直鎖状対応物と比較して強化された細胞間透過性を示した。
生物学的障壁を克服するための大きな可能性を秘めており、薬物送達の分野でのさらなる応用のための分子に使用されると信じています。
