著者らは、有用な議論をエレノアフレミングとジェシカ陳に感謝します。資金は、国立アレルギー感染病研究所（NIH - NIAID）賞R15AI079685とリサーチ株式会社コットレル大学科学賞によって提供されていました。追加の学生支援は、ハワードヒューズ医学研究所とStaley氏の資金によって提供されていました。

1。ラージユニラメラ脂質小胞の調製（LUVs） <ol><li>アッセイ19細胞膜を模倣として機能するLUVsを準備します。 </li><li>ミックスホスファチジルコリン（POPC、760.10グラム/モル）、ホスファチジルグリセロール（POPG. 770.99グラム/モル）、5 - ジメチルアミノナフタレン-1 - スルホニル50でクロロホルムに溶解したホスファチジルエタノールアミン（DNS - POPE、994.350グラム/モル）（アヴァンティ極性脂質） ：45:5の比率。すべてのアッセイは、実験群とコントロールの両方LUVsの別々の準備を必要とするとして、2つの脂質ケーキのバイアルを準備する必要があります。総脂質の0.376ミリグラム（0.188 mgをPOPC、0.169 mgのPOPG、および0.019 mgのDNS - POPE）は通常、単一の転座試験のために十分な小胞を作るのに十分です。 </li><li> N 2ガ ​​ス流を用いてクロロホルム蒸発。 </li><li>真空デシケーター内の脂質のケーキ9月14日時間を乾かします。 </li><li>株式の10 mM HEPES緩衝液（10mMのHEPES、238.3グラム/モル、45 mMのNaCl、58.44グラム/モル、1mMのEDTA、372.24グラム/モルpH7.4）を準備します。 HEPESバッファーはSTです。4℃で論理和</li><li>上記で調製した10 mMのHEPES緩衝液に0.4mMのブタトリプシン（23.3キロ/モル）のストック溶液を調製。トリプシンは、-20℃で保存されており、私たちの実践で、通常使用の前に2つ以上の凍結融解サイクルを受けることはありません。 </li><li> -20℃で、10mMのHEPES緩衝液、店舗には4.0 mMのボーマン - バークトリプシンインヒビター（8キロ/モル）のストック溶液を調製私たちの使用では、この株式は毎月補充されると、それが再び行われる前に通常3つ以上の凍結/融解サイクルを受けることはありません。 </li><li> 0.4mMのトリプシンの株式や乾燥脂質のケーキ〜10 mMのHEPES緩衝液の等量を追加することにより、0.2mMのトリプシン溶液で再構成実験的な多重膜小胞（MLVは）。 0.376 mg総脂質の一つのサンプルの場合は、トリプシン溶液とHEPES緩衝液150μL150μLの混合物で十分です。 </li><li> 0の等量を追加することによって、0.2mMのトリプシンと2.0 mMのボーマン - バークトリプシンインヒビターとソリューションで再構成制御MLVは。4mMのトリプシンの株式や乾燥脂質ケーキ〜4.0 mMのトリプシンインヒビター。 0.376 mg総脂質の一つのサンプルの場合は、トリプシン溶液とトリプシンインヒビターの150μLの150μLの混合物で十分です。 </li><li>ガラスバイアルから1.7 mlのマイクロ遠心チューブに転送MLVソリューション。 </li><li>液体窒素で5凍結/解凍サイクルに従うMLVソリューション。 </li><li>各テフロン押出片にHEPES緩衝液で湿らせた二つのフィルターをサポートして配置することにより、脂質の押出機（アヴァンティ極性脂質）を準備します。 twoテフロン押出片の間に0.1μmの孔（ワットマン、イギリス）とnucleporeトラックエッチング膜を置き、金属の押出機のキャニスター内の押出機のピースを置きます。押出機のキャニスターの金属の上部を締めてホルダーにそれを置く前に、2つの押出機の片上のドーナツのスペーサを置きます。 </li><li>小胞のサンプルの損失を防ぐために、250μLのガラスシリンジを用いて、500μLの10mM HEPES緩衝液で押出機内空隙容積を埋める。&lt;/ LI&gt; <li>押出機にそれぞれのMLVのサンプルをロードし、膜を介して均一な単層ベシクルのサイズを確保するために少なくとも21回のサンプルを押してください。 LUVsは、MLVのソリューションは、次の押し出しから取得されます。 </li><li> 4℃店舗LUVs℃、48時間以内に使用する。 </li></ol> 2。定量化は、濃度をLUVは<ol><li>マブラヴ濃度は、試料20の全リンの含有量を測定することによって定量した。 </li><li>室温でnanopure水に濡らしたりの8.9 NH 2 SO 4を準備します。 </li><li> nanopure水では2.5％w / vのアンモニウムモリブデン酸VI（588.04グラム/モル）溶液を調製します。 10パーセントw / vのアスコルビン酸（176.1グラム/モル）nanopure水の溶液を調製します。ホイルで管を覆うことにより、露光からアスコルビン酸溶液を保護する。最大2ヶ月間4℃で両方のソリューションを保管してください。 </li><li> 0.65 mMリン酸緩衝液（一塩基性無水リン酸ナトリウム、120 g /モル）を準備します。 </li><li> 6つの標準TUを準備BES。規格は0.0μL、50μL（0.0325μモル）、100μL（0.065μモル）、175μL（0.114μモル）、250μL（0.163μモル）、またはリン溶液350μL（0.228μモル）を含める必要があります。 </li><li>三連でサンプルチューブをLuvの準備。各サンプルチューブはLUVsの約0.1μモルが含まれている必要があります。実験群とコントロールは、濃度を個別に測定する必要がありますLUVは。 </li><li>ボーマン - バークインヒビターの粉の任意の乾燥リン酸塩を補正するためには、コントロールは空白が準備されている必要がありますLUVは。サンプルチューブをLuvのコントロールに配置されたとしてブランク、0.2 mMのtrypsin/2.0 mMのボーマン - バーク阻害剤溶液の同量が含まれている必要があります。 </li><li>標準試料、およびブランクチューブのそれぞれに8.9 NH 2 SO 4の代わりに450μL。 </li><li>熱のサンプル、標準、および175から210で25分間の空白°オーブンでC。 </li><li>全てのチューブを取り外し、それらを冷却することができます。 TUのそれぞれに30％H 2 O 2の150μLを追加BES。 </li><li>熱のサンプル、標準、および175から210で30分間の空白℃、 </li><li>サンプル、基準、および熱からブランクを取り外します。ソリューションのいずれかがまだ無色ではない場合、175から210でさらに15分間、すべてのチューブと熱℃に50μLH 2 O 2を追加</li><li> 3.9 mLのnanopure H 2 O、0.5 mLのモリブデン酸アンモニウム溶液と各チューブに0.5 mLのアスコルビン酸溶液を加える。 </li><li>沸騰水浴中で5〜7分間、すべてのチューブを加熱する。 </li><li> Agilentの8453紫外可視分光光度計を用いて820 nmで、それぞれ標準とサンプルの吸光度を測定します。 0.0ミリモルのリンを含むチューブは、すべての規格の空白として使用され、実験的にサンプルをLUVはされるべきである。 0.2mMのtrypsin/2.0 mMのボーマン - バーク阻害剤溶液を含むチューブはサンプルをマブラヴ制御するための空白として使用する必要があります。 </li><li>リニア吸光度対リンコンテンツの標準曲線を作製し、合計phosphを計算するために使用することができます。orusのコンテンツとサンプルの濃度をLUVは。 </li></ol> 3。ペプチド溶液の準備<ol><li> nanopure H 2 Oにペプチドを溶かす説明に従って、このアッセイで使用されているペプチド一トリプトファン残基が含まれている必要があります。 </li><li>三連の282 nmでのペプチド溶液の吸光度を測定します。 5700 M -1 cm -1のトリプトファンのモル吸光係数を用いてペプチドの濃度を計算する。 </li><li> 30μMの最終濃度までnanopure水のペプチドを希釈する。 -20℃で保存</li></ol> 4。転座定量<ol><li>を1.7 mLのマイクロ遠心チューブ中で実験群とコントロールサンプルを準備します。 250μMの最終濃度は、各ソリューションに十分なLUVsを追加。その阻害剤は、トリプシンの濃度より10倍も大きいの最終濃度になるように十分なボーマン - バークインヒビター溶液を加える。 450μLに最終的なソリューションのボリュームをもたらすのに十分な、10mMのHEPES緩衝液を追加します。 </li> &lt;Starnaマイクロ石英の蛍光光度計のセルへのLi&gt;場所50μLのペプチド溶液。 LUVsとペプチドとの間の比はほぼすべての無傷のペプチドはいずれも小胞に転いない場合でも、FRETシグナルを与えるためにダンシル基の十分近くに近接していることを保証するために十分に高いです。これは、何と小胞内に移行していないペプチドの制御条件において観察されたFRETが似と一致しています。 </li><li>キュベット内のペプチド溶液に、実験またはコントロールサンプルを追加。これは、3μMの最終ペプチド濃度を持参してください。 </li><li>少なくとも1秒間に1回ずつ蛍光読書をしながら、ソリューションをマブラヴの実験またはコントロールを添加するとすぐに 25分の蛍光反応速度の実験を始める。 25に280nmの励起波長は525 nmでの発光波長、および温度を℃に設定キャリーのEclipse蛍光分光光度計を使用して、我々は高いのPMT感度を設定します。 </li></ol><html> 5。定量的転率を生成<ol><li>データ収集の15秒後の蛍光読書として、初期の蛍光（F O）を定義する。当社の機器のセットアップでは、我々は収集した蛍光データの最初の15秒サンプルを添加するとシステムにサンプルチャンバーを閉じ、そして他の摂動、原因混合に信頼性であることを見出した。各時点での相対的な蛍光（F / F 0）を取得するためにF oで後続の各測定値を割ります。 </li><li>平均的な実験の最後の分からすべての相対的な蛍光の測定値が最終的な平均的な相対的な蛍光を得るために<img alt="[F / FO] AVG" src="/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg" /> 。 </li><li>分割<img alt="[F / FO] AVG" src="/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg" />による制御のサンプル用<img alt="[F / FO] AVG" src="/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg" />実験試料の補正を最終蛍光値を取得する。 </li></ol>ル&quot;&gt; 6。代表的な結果図2は、堅牢な転座を示した代表的なペプチドのためのこのアッセイの結果を示しています。この実験における信号（黒のトレースは）時間をかけてFRETシグナルの著しい低下を示しています。しかし、それは不完全なトリプシンの阻害または転座の能力とは無関係な他の要因によるFRETシグナルの潜在的な損失を制御することが重要である。この目的のために、我々は常にもペプチドとトリプシンとボーマン - バークトリプシンインヒビター（グレーのトレース、図2）の両方を含むLUVs間でFRETシグナル測定する。私たちの手で、それは実験が実行されるたびにすべてのペプチドは、このコントロールを実行するために重要であった。これは、私たちは明らかに一般的にこれらの濃度で観察された比較的弱い蛍光シグナルに大きな影響を与えることができる脂質の小胞の調製品や楽器の音、間の相違に起因する信号の変化を補正することができます。 コントロールEXPEの重要性トリプシンインヒビターを含むLUVsを使用してrimentは、図3に示すようにデータによって強調表示されます。このケースでは、ペプチドシグナルは、実験サンプル（黒のトレース）の図2のような量を減少させた。しかし、対照サンプルは、このペプチドのためのより急速な減少を示していますので、その正味の転座が低くなります。 我々のプロトコルのセクション5では、この実験から、転座を定量化する簡単な方法を説明します。高い転座の比率は、効率的に転位するペプチドを示すものであり、図2に示すように細胞透過性ペプチドのための転座の比は1.16であり、弱く転位ペプチドが1に近いほど、転座の比率を持っている。我々の経験では、別の小胞の準備を行う3つの独立した実験のための標準誤差は0.01〜0.06の範囲内です。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3571/3571fig1.jpg" /> 図1。 translocatの回路図イオンアッセイ実験は試料を（）蛍光ダンシルPOPE（黒棒）でドープされ、トリプシン（はさみ）をカプセル化含むLUVは。トリプシンインヒビター（赤い円）がLUVs外にトリプシンを阻害するために使用されます。 LUVsは、ペプチド（紫）にさらされている。とペプチド会合はtransloctingペプチドが遠慮のない内部トリプシンが発生したとして減少する信号（緑）をFRETが膜の歩留まりをLUVは。トリプシンとトリプシンインヒビターの両方をコントロールにカプセル化されている（B）転座に関係のないFRETシグナルの減少を測定するためにサンプルをLUVは。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3571/3571fig2.jpg" /> 図2。細胞透過性ペプチドのための代表的なデータが。抗菌pepideを転位担当者は、その制御に比べてFRETシグナルが大幅に低下を示しています。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3571/3571fig3.jpg" /> 図3。コントロールの重要性を強調する代表的なデータは非転位ペプチドのトリプシン消化の不完全な抑制は、実験群とコントロールの両方で時間をかけてFRETシグナルの低下につながるソリューションをLUVは。コントロールと実験的なトレースの差が比較的小さいため、この変異体は弱く転位ペプチドとして特徴付けられる。

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Biopharm. 58 (2), 209-209 (2004).</li><li>Temsamani, J., Vidal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+cell-penetrating+peptides+for+drug+delivery.">The use of cell-penetrating peptides for drug delivery.</a> Drug Discov. Today. 9 (23), 1012-1012 (2004).</li><li>Hale, J. D., Hancock, R. 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Biol. 345 (2), 387-387 (2005).</li><li>Bárány-Wallje, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+reassessment+of+penetratin+translocation+across+lipid+membranes.">A critical reassessment of penetratin translocation across lipid membranes.</a> Biophys. J. 89 (4), 2513-2513 (2005).</li><li>Henriques, S. T., Costa, J., Castanho, M. 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T., Costa, J., Castanho, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluating+the+role+of+strongly+charged+sequences+in+amphipathic+cell-penetrating+peptides:+a+fluorescence+study+using+Pep-1.">Re-evaluating the role of strongly charged sequences in amphipathic cell-penetrating peptides: a fluorescence study using Pep-1.</a> FEBS Lett. 579 (20), 4498-4498 (2005).</li><li>Torchilin, V. P., Weissig, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Liposomes. , (2003).</li><li>Almeida, P. F., Pokorny, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avanti+Polar+Lipids,+Determination+of+Total+Phosphorus.">Avanti Polar Lipids, Determination of Total Phosphorus.</a> Biochemistry. 1686 (34), 8083-8083 (2009).</li><li>Kobayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+translocation+mechanism+of+the+antimicrobial+peptide+buforin+2.">Membrane translocation mechanism of the antimicrobial peptide buforin 2.</a> Biochemistry. 43 (49), 15610-15610 (2004).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

ここで紹介するプロトコルは、内部および脂質小胞の外側のペプチドの濃度の相対的な変化を評価するために使用することができます。これらの変更は、転座の能力に関連しています。このプロトコルは、薬物送達ベクターとしての可能性と細胞透過性ペプチドを同定するために使用することができます。細胞透過性ペプチドへの関心が拡大するにつれ、それは直接転座のイベントを測定す?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> 16:0-18:1 PG </td><td>アヴァンティ極性脂質</td><td> 840457C </td></tr><tr><td> 1時18ダンシルPE </td><td>アヴァンティ極性脂質</td><td> 810330C </td></tr><tr><td> 16:0-18:1 PC </td><td>アヴァンティ極性脂質</td><td> 850457C </td></tr><tr><td>ブタトリプシン</td><td>シグマ</td><td> T - 0303 </td></tr><tr><td>ボーマン - バークトリプシン/キモトリプシン阻害剤</td><td>シグマ</td><td> T - 9777 </td></tr><tr><td>ミニ押出機</td><td>アヴァンティ極性脂質</td><td> 61万</td></tr><tr><td>モリブデン酸アンモニウム（パラ） </td><td>アルファAesar </td><td> 10811 </td></tr><tr><td> L -アスコルビン酸</td><td>シグマ</td><td> A1417 </td></tr><tr><td>過酸化水素、30％溶液</td><td> Mallinckrodt化学物質</td><td> 5240〜05 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td>シグマ</td><td> H - 3375 </td></tr><tr><td> NaClを</td><td>シグマ</td><td> S - 9625 &lt;/ TD&gt; </tr><tr><td> EDTA </td><td>シグマ</td><td> E5134 </td></tr><tr><td>のNaH 2 PO 4 </td><td>シグマ</td><td> S - 0751 </td></tr></tbody></table>

measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles

容易に細胞膜の受容体1の支援なしに細胞膜を通過ペプチドに積極的に関心があります。これらの多くは、頻繁に1から3の薬物送達ベクターとしての可能性で注目されて細胞透過性ペプチド、と呼ばれています。また、特に4,5以外の膜溶解メカニズム、細胞溶解を引き起こすことなく、細菌の膜を通過し、細胞内プロセス6,7に干渉することによって細胞を殺すものを介して動作抗菌ペプチドの関心が高まっている。実際に、著者らはますます細胞透過性と抗菌ペプチド1,8の間の関係を指摘している。膜の転座とペプチドの構造と転位する能力との関係のプロセスのしっかりとした理解は、転座のための効果的な、再現性のアッセイを必要とします。いくつかのグループは、大きなunilamelに転座を測定する手法を提案したLAR脂質小胞（LUVs）9-13 LUVsは、細菌と真核生物の細胞膜の有用なモデルとなると頻繁に14,15ペプチド蛍光の研究に使用されています。ここで、我々はまずそのようなマガイニンとbuforin II 16,17のような抗菌性ペプチドを、考慮する松崎と共同研究者によって開発された方法の我々のアプリケーションについて説明します。この方法のために我々のプロトコルを提供することに加えて、我々はまた、このアッセイを用いて転座の能力を定量データ分析への直接的なアプローチを提示する。他人と比較してこの転座アッセイの利点は、それが膜の転座の割合に関する情報を提供する可能性を秘めているとトリプトファン含有ペプチドにペプチドの特性18を 、変えることができる蛍光標識、の加算を必要としないことです。簡潔に、脂質小胞へのトランスロケーション機能は、ネイティブのトリプトファン残基とdの間にフォスターの共鳴エネルギー移動（FRET）の関数として測定されますタンパク質が外部に関連付けられているansylホスファチジルエタノールアミンは、膜（図1）LUVは。彼らはLUVsでカプセル化された制約のないトリプシンが発生したとして、細胞透過性ペプチドは、マブラヴ膜とFRETシグナルの減少から解離につながる、切断されています。 LUVsがトリプシンおよびトリプシンインヒビター、またはときに自発的に脂質膜を通過していないペプチドをトリプシン含有LUVsにさらされている両方が含まれているときに転位ペプチドで観察されたFRETシグナルの低下は、同一のペプチドで観察されたものよりかなり大きいです。蛍光の変化は、時間の経過ペプチド転座の直接定量を提供します。

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Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

このプロトコルの詳細、大きな一枚膜脂質小胞へのペプチド移行の定量的測定のための方法。また、このメソッドは、膜の転座の割合に関する情報を提供し、効率的かつ自発的に脂質二重層を横切るペプチドを同定するために使用することができます。

大型単層小胞へのペプチドの転座の測定

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

measuring-peptide-translocation-into-large-unilamellar-vesicles

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JoVE Journal

Biology

13.8K ビュー.  Wellesley College. このプロトコルの詳細、大きな一枚膜脂質小胞へのペプチド移行の定量的測定のための方法。また、このメソッドは、膜の転座の割合に関する情報を提供し、効率的かつ自発的に脂質二重層を横切るペプチドを同定するために使用することができます。

ビデオ: Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation. Generating a streamlined procedure for creating and screening metagenomic libraries is therefore useful for efficient high-throughput investigations into the genetic and metabolic properties of uncultured microbial assemblages. Here, key protocols are presented on video, which we propose is the most useful format for accurately describing a long process that alternately depends on robotic instrumentation and (human) manual interventions. First, we employed robotics to spot library clones onto high-density macroarray membranes, each of which can contain duplicate colonies from twenty-four 384-well library plates. Automation is essential for this procedure not only for accuracy and speed, but also due to the miniaturization of scale required to fit the large number of library clones into highly dense spatial arrangements. Once generated, we next demonstrated how the macroarray membranes can be screened for genes of interest using modified versions of standard protocols for probe labeling, membrane hybridization, and signal detection. We complemented the visual demonstration of these procedures with detailed written descriptions of the steps involved and the materials required, all of which are available online alongside the video.

メタゲノムライブラリの大規模スクリーン

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

生物学

Large Insert Environmental Genomic Library Production

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent environmental genomic (i.e. metagenomic) approaches have emerged, enabling researchers to bridge this cultivation gap by capturing the genetic content of indigenous microbial communities directly from the environment. To this end, genomic DNA libraries are constructed using standard albeit artful laboratory cloning techniques. Here we describe the construction of a large insert environmental genomic fosmid library with DNA derived from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord. This protocol is directly linked to a series of connected protocols including coastal marine water sampling [1], large volume filtration of microbial biomass [2] and a DNA extraction and purification protocol [3]. At the outset, high quality genomic DNA is end-repaired with the creation of 5 -phosphorylated blunt ends. End-repaired DNA is subjected to pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) for size selection and gel extraction is performed to recover DNA fragments between 30 and 60 thousand base pairs (Kb) in length. Size selected DNA is purified away from the PFGE gel matrix and ligated to the phosphatase-treated blunt-end fosmid CopyControl vector pCC1 (EPICENTRE <a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385">http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>). Linear concatemers of pCC1 and insert DNA are subsequently headfull packaged into phage particles by lambda terminase, with subsequent infection of phage-resistant E. coli cells. Successfully transduced clones are recovered on LB agar plates under antibiotic selection and archived in 384-well plate format using an automated colony picking robot (Qpix2, GENETIX). The current protocol draws from various sources including the CopyControl Fosmid Library Production Kit from EPICENTRE and the published works of multiple research groups [4-7]. Each step is presented with best practice in mind. Whenever possible we highlight subtleties in execution to improve overall quality and efficiency of library production. The whole process of fosmid library production and automated colony picking takes at least 7-10 days as there are many incubation steps included. However, there are several stopping points possible which are mentioned within the protocol.

Construction of a fosmid library with environmental genomic DNA isolated from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord is described. The resulting clone library is picked into 384-well plates and archived for downstream sequencing and functional screening by the application of an automated colony picking system.

大規模な挿入環境ゲノムライブラリーの製造

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

異種哺乳動物細胞で発現したイオンチャネルの変異導入と機能解析

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

フローサイトメトリーによる細胞膜へのGLUT4転の定量的測定

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic development 1, 2. One of the signaling pathways involved in this regulation is the Wnt pathway, which is used many times during embryogenesis and critical for human disease3, 4, 5. Multiple molecular components of this pathway coordinately regulate signaling in a spatially-restricted manner, but the underlying mechanisms are not fully understood. Xenopus embryonic epithelial cells is an excellent system to study subcellular localization of various signaling proteins. Fluorescent fusion proteins are expressed in Xenopus embryos by RNA microinjection, ectodermal explants are prepared and protein localization is evaluated by epifluorescence. In this experimental protocol we describe how subcellular localization of Diversin, a cytoplasmic protein that has been implicated in signaling and cell polarity determination6, 7 is visualized in Xenopus ectodermal cells to study Wnt signal transduction8. Coexpression of a Wnt ligand or a Frizzled receptor alters the distribution of Diversin fused with red fluorescent protein, RFP, and recruits it to the cell membrane in a polarized fashion 8, 9. This ex vivo protocol should be a useful addition to in vitro studies of cultured mammalian cells, in which spatial control of signaling differs from that of the intact tissue and is much more difficult to analyze.

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Xenopus embryonic ectoderm has become an attractive model for studies of cell polarity. An assay is described, in which subcellular distribution of fluorescent proteins is assessed in ectoderm cells. This protocol will help address questions related to spatial control of signaling.

の蛍光タンパク質の偏転アフリカツメガエルWntシグナルへの対応に>外胚葉

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic ...

Examining BCL-2 Family Function with Large Unilamellar Vesicles

The BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) family is comprised of approximately twenty proteins that collaborate to either maintain cell survival or initiate apoptosis1. Following cellular stress (e.g., DNA damage), the pro-apoptotic BCL-2 family effectors BAK (BCL-2 antagonistic killer 1) and/or BAX (BCL-2 associated X protein) become activated and compromise the integrity of the outer mitochondrial membrane (OMM), though the process referred to as mitochondrial outer membrane permeabilization (MOMP)1. After MOMP occurs, pro-apoptotic proteins (e.g., cytochrome c) gain access to the cytoplasm, promote caspase activation, and apoptosis rapidly ensues2.
In order for BAK/BAX to induce MOMP, they require transient interactions with members of another pro-apoptotic subset of the BCL-2 family, the BCL-2 homology domain 3 (BH3)-only proteins, such as BID (BH3-interacting domain agonist)3-6. Anti-apoptotic BCL-2 family proteins (e.g., BCL-2 related gene, long isoform, BCL-xL; myeloid cell leukemia 1, MCL-1) regulate cellular survival by tightly controlling the interactions between BAK/BAX and the BH3-only proteins capable of directly inducing BAK/BAX activation7,8. In addition, anti-apoptotic BCL-2 protein availability is also dictated by sensitizer/de-repressor BH3-only proteins, such as BAD (BCL-2 antagonist of cell death) or PUMA (p53 upregulated modulator of apoptosis), which bind and inhibit anti-apoptotic members7,9. As most of the anti-apoptotic BCL-2 repertoire is localized to the OMM, the cellular decision to maintain survival or induce MOMP is dictated by multiple BCL-2 family interactions at this membrane.
 Large unilamellar vesicles (LUVs) are a biochemical model to explore relationships between BCL-2 family interactions and membrane permeabilization10. LUVs are comprised of defined lipids that are assembled in ratios identified in lipid composition studies from solvent extracted Xenopus mitochondria (46.5% phosphatidylcholine, 28.5% phosphatidylethanoloamine, 9% phosphatidylinositol, 9% phosphatidylserine, and 7% cardiolipin)10. This is a convenient model system to directly explore BCL-2 family function because the protein and lipid components are completely defined and tractable, which is not always the case with primary mitochondria. While cardiolipin is not usually this high throughout the OMM, this model does faithfully mimic the OMM to promote BCL-2 family function. Furthermore, a more recent modification of the above protocol allows for kinetic analyses of protein interactions and real-time measurements of membrane permeabilization, which is based on LUVs containing a polyanionic dye (ANTS: 8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid) and cationic quencher (DPX: p-xylene-bis-pyridinium bromide)11. As the LUVs permeabilize, ANTS and DPX diffuse apart, and a gain in fluorescence is detected. Here, commonly used recombinant BCL-2 family protein combinations and controls using the LUVs containing ANTS/DPX are described.

Biochemically-defined large unilamellar vesicles (LUVs) are a convenient model system to analyze BCL-2 family interactions with immediate implications in better understanding the mitochondrial pathway of apoptosis. A method to produce LUVs, along with standard BCL-2 family protein combinations and controls to examine LUV permeabilization, are presented.

大型単層小胞とBcl-2ファミリーの機能を調べる

The BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) family is comprised of approximately twenty proteins that collaborate to either maintain cell survival or initiate ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow GUVs must be modified in order to form GUVs containing functional transmembrane proteins. This article describes two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation and gel-assisted swelling &#8212; to form GUVs containing the voltage-gated potassium channel, KvAP. In both methods, a solution of protein-containing small unilamellar vesicles is partially dehydrated to form a stack of membranes, which is then allowed to swell in a rehydration buffer. For the electroformation method, the film is deposited on platinum electrodes so that an AC field can be applied during film rehydration. In contrast, the gel-assisted swelling method uses an agarose gel substrate to enhance film rehydration. Both methods can produce GUVs in low (e.g., 5 mM) and physiological (e.g., 100 mM) salt concentrations. The resulting GUVs are characterized via fluorescence microscopy, and the function of reconstituted channels measured using the inside-out patch-clamp configuration. While swelling in the presence of an alternating electric field (electroformation) gives a high yield of defect-free GUVs, the gel-assisted swelling method produces a more homogeneous protein distribution and requires no special equipment.

The reconstitution of the transmembrane protein, KvAP, into giant unilamellar vesicles (GUVs) is demonstrated for two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation, and gel-assisted swelling. In both methods, small unilamellar vesicles containing the protein are fused together to form GUVs that can then be studied by fluorescence microscopy and patch-clamp electrophysiology.

膜貫通タンパク質の再構成、顕微鏡およびパッチクランプ研究のための巨大単膜小胞への電位依存性イオンチャネル、KvAP、

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

ペプチドを結合蛍光タンパク質のDNAを用いた表面係留大型DNA分子の可視化

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many different proteins associate with curved membranes because of their ability to sense or induce membrane curvature. Typically, these processes involve a multitude of proteins making them too complex to study quantitatively in the cell. We describe a protocol to reconstitute a curved membrane in vitro, mimicking a curved cellular structure, such as the endocytic neck. A giant unilamellar vesicle (GUV) is used as a model of a cell membrane, whose internal pressure and surface tension are controlled with micropipette aspiration. Applying a point pulling force on the GUV using optical tweezers creates a nanotube of high curvature connected to a flat membrane. This method has traditionally been used to measure the fundamental mechanical properties of lipid membranes, such as bending rigidity. In recent years, it has been expanded to study how proteins interact with membrane curvature and the way they affect the shape and the mechanics of membranes. A system combining micromanipulation, microinjection, optical tweezers, and confocal microscopy allows measurement of membrane curvature, membrane tension, and the surface density of proteins, concurrently. From these measurements, many important mechanical and morphological properties of the protein-membrane system can be inferred. In addition, we lay out a protocol of creating GUVs in the presence of physiological salt concentration, and a method of quantifying the surface density of proteins on the membrane from fluorescence intensities of labeled proteins and lipids.

Many proteins in the cell sense and induce membrane curvature. We describe a method to pull membrane nanotubes from lipid vesicles to study the interaction of proteins or any curvature-active molecule with curved membranes in vitro.

巨大リポソームの膜カーボンナノ チューブを引っ張ってください。

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, which leads to subsequent degeneration of vital retinal structures (e.g., photoreceptors) causing severe vision impairment. Similarly, RPE-loss and decrease in visual acuity is seen in long-term follow up of patients with advanced wet age-related macular degeneration (AMD) receiving intravitreal anti-vascular endothelial growth factor (VEGF) treatment. Therefore, on the one hand, it is fundamental to efficiently derive RPE cells from an unlimited source that could serve as replacement therapy. On the other hand, it is important to assess the behavior and integration of the derived cells in a model of the disease entailing surgical and imaging methods as close as possible to those applied in humans. Here, we provide a detailed protocol based on our previous publications that describes the generation of a preclinical model of GA using the albino rabbit eye, for evaluation of the human embryonic stem cell derived retinal pigment epithelial cells (hESC-RPE) in a clinically relevant setting. Differentiated hESC-RPE are transplanted into naive eyes or eyes with NaIO3-induced GA-like retinal degeneration using a 25 G transvitreal pars plana technique. Evaluation of degenerated and transplanted areas is performed by multimodal high-resolution non-invasive real-time imaging.

Retinal pigment epithelial cells could serve as a cell-replacement therapy for the advanced form of dry age-related macular degeneration. This protocol describes the generation of a large-eyed model of geographic atrophy and the subretinal transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells into this model of disease.

地図状委縮の目の大きいモデルにヒト胚性幹細胞由来網膜色素上皮細胞の網膜下移植

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...