著者たちは、エミリー・ジョッセが原稿の批判的なレビューに感謝したいと思います。この作品は、財団「ラ・リーグ・コントル・ル・ガン」「フォンダシオンARCはラ・レシェルシュ・シュル・ル・ガンを注ぐ」、そして「センター・ナショナル・デ・ラ・レシェルシュ・サイエンティフィック」(CNRS)によって支えられました。

1. 大型ユニラメラベシクル(RV)の調製
<ol><li>蛍光漏れ測定のための細胞膜模倣として使用するためのLUVを準備します。</li>
	<li>ハミルトンガラス注射器ホスファチジルコリン(DOPC、786.11 g/mol)、スフィンゴミエリン(SM、760.22 g/mol)、コレステロール(Chol、386.65 g/mol)をモル比4:4:2で混ぜます。脂質溶液は、25 mLガラス丸底フラスコで25mg/mLのメタノール/クロロホルム(3/1;体積/体積)溶媒で可溶化した各脂質のストック溶液から得られます。4 μmolの DOPC、4 μmol SM、および 2 μmol の Chol に基づいて、脂質溶液は、それぞれ 126 μL、117 μL、および 31 μL を混合してストック溶液から得られます。 注意:メタノールは有毒で可燃性の溶媒であり、クロロホルムは有毒で発がん性があります。どちらもフードの下で適切な保護で処理する必要があります。</li>
	<li>乾燥した脂質膜の形成まで60°Cで45〜60分の真空下でロータリーエバポレーターを使用してメタノール/クロロホルムを蒸発させます。</li>
	<li>2つのストックHEPESバッファソリューションを準備します。HEPES バッファー 1 を 20 mM HEPES (238.3 g/mol) と 75 mM NaCl (58.44 g/mol) を混合して準備し、pH を 7.4 に調整します。20 mM HEPES と 145 mM NaCl を混合して HEPES バッファー 2 を準備し、pH を 7.4 に調整します。HEPESバッファーは、4°Cで1ヶ月間保存することができます。 メモ:オスマメーターを使用してバッファの浸透圧を確認することをお勧めします。</li>
	<li>膜不浸透性蛍光色素クエンチャーカップル、8-アミノナフタレン-1、3、6-トリスルホン酸、12.5mM(ANTS、427.33 g/mol)の二ナトリウム塩、45 mM(DPX、422.16)の臭化液中にp-キシレンバイスピリジウム臭化物を溶解して脂質水和液を調製する。DPXとアリを混合すると、黄色の溶液が出ます。12.5 mMのANTSと45 mMのDPXの濃度を達成するために、HEPESバッファー1の4 mLにそれぞれ21.4mgおよび76mgを溶解する。 注:脂質ハイドレーション溶液は、チューブをアルミホイルで包むことで4°Cで2週間保存することができます。</li>
	<li>リコンセシスマルチラメラ小胞(MLV)は、乾燥した脂質水和溶液の1mLで乾燥した脂質膜を再懸濁し、乾燥した脂質膜を溶解するまでボルテックスすることにより行う。小さな脂質凝集体が前のステップに悪影響を及ぼすため、溶液が完全に可溶化していることを確認してください。また、ガラス丸底フラスコの壁面を確認して、残っている脂質フィルムがないことを確認します。 注: 溶液は可溶化後に青白色と淡黄色で表示されます。</li>
	<li>小胞を5回凍結/解凍サイクルにして、単層小胞を得る。凍結ステップのために液体窒素に30sのガラス丸底フラスコを入れて、解凍ステップのために2分間水浴に残すことによって、各サイクルを実行します。 注:浴水の温度は、脂質の溶融温度よりも5〜10°C高くする必要があります。</li>
	<li>2つのフィルターを挿入して脂質押出機を準備し、各ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)押出機片にHEPESバッファーを用いて予備加湿をサポートし、金属押出機キャニスターに入れ加工する。</li>
	<li>1つのフィルターサポートの上部にHEPES加湿ポリカーボネート膜(0.1 μmの細孔サイズ、直径25mm)を入れます。</li>
	<li>2つの金属押出機キャニスターを組み立て、ねじ込みます。</li>
	<li>組み立てた押出機をホルダーに入れ、各ポリテトラフルオロエチレン押出機片の先端部に適当な穴に1mLシリンジを導入します。押出は、ポリカーボネート膜を通して一方のシリンジから他方への検査された液体の通過に相当する。</li>
	<li>1 mL シリンジの 1 つに HEPES バッファーを 1 mL ロードして押出機をテストし、漏れや問題がないことを確認します。</li>
	<li>1 mL HEPES バッファーを MLV サンプルに交換します。</li>
	<li>MLVサンプルを一方のシリンジから他方のシリンジに少なくとも21回通し、同じサイズの均一なRVを得ることによって押出を行う。 注:押出は、脂質混合物の溶融温度よりも高い温度で行われるべきです。</li>
</ol>2. ルブの浄化
<ol><li>非カプセル化されたANTSおよびDPX過剰を除去するためにカラム精製を準備する。</li>
	<li>液体クロマトグラフィーカラム(ルアーロック、ノンジャケット、1.0cm x 20cm、ベッド容積16mL)に0.01%NaN 3(65g/mol)を含む水媒体に再懸濁された架橋デキストランゲル(G-50)を、無色部分の上部から1cm下に1cm下に導入します。</li>
	<li>タップを開き、液体を流して架橋ドキストランゲルを落ち着かせる。</li>
	<li>20mLのHEPESバッファー2で溶出してカラムを洗浄し、カラムの出力フローを廃棄します。</li>
	<li>カラム上の溶媒のデッドボリュームが最小になったら(<100 μL)、架橋ドキストランゲルの乾燥を避けるために十分な後にタップを閉じます。</li>
	<li>押し出したてのSUV(黄色)をコラムに置き、架橋されたデキストランゲルに入ります。</li>
	<li>列にHEPESバッファー2を連続的に加え、LUV精製を行う。</li>
	<li>約2mLのHEPES緩衝液2(架橋ドキストランゲルの乾燥を避けるためにカラムの上部を定期的に充填することを忘れないでください):フリーイエローANTSおよびDPX溶液はリポソームよりも遅く移行します。</li>
	<li>チューブ(1.5 mL)内の精製されたLUVの収集を開始します。</li>
	<li>カラムからの溶離液の滴を観察し、それらが乳白色になると、リポソームが含まれています。チューブを変更して、LUV含有分率を回復します。</li>
	<li>滴がもはや青白色(〜1 mL)になるまでエルテ。その後、別の分数で別の0.5 mLを溶出し、溶出を停止します。 注: キットや個々の分子量として、UV の溶出量を校正するために、幅広い分子量で規格が利用可能になりました。</li>
	<li>蛍光色素の漂白を避けるために、チューブをアルミニウム箔でチューブに包みます。</li>
	<li>20 mL HEPES バッファー 2 でカラムを洗います。</li>
	<li>その後、RVは4°Cで1週間保存することができます。 注意:LUVの安定性は、LUVの濃度と構成、およびイオン強度に依存する可能性があるため、LUVのサイズはダイナミック光散乱(DLS)機器を使用して制御する必要があります(セクション4を参照してください。各テストの前に、LUV サイズと同質性の特性を示します。</li>
</ol>3. LUV の濃度を定量化する
<ol><li>リン脂質定量キットによるLUV濃度を推定し、コリン濃度19の評価を可能にする。このアッセイは、極性頭部を含むコリンを含むリン脂質が実質的である場合に適用される可能性があります(rvvの>50%)。</li>
	<li>18mgのクロモーゲン基質を3mLのバッファーに溶解して色試薬を調製する。</li>
	<li>ポリスチレンキュベットをロード, 10 x 10 x 45 mm, 色試薬の 3 mL.</li>
	<li>純色試薬をブランク条件(ブランク)として使用してください。LUVサンプル(テスト)または既知のコリン濃度の標準溶液の20 μLを追加します(標準)。</li>
	<li>よく混ぜ、37 °Cのすべての条件(ブランク、テスト、および標準)で5分間インキュベートします。</li>
	<li>試験試料の吸光度(光学密度、OD)を測定し、スペクトロフォトメーターで600nmでコントロールするブランク溶液を用いて標準溶液を測定します。</li>
	<li>既知の濃度の標準と比較して、コリン相当のRVの脂質濃度を推定することを可能にするOD値をチェックしてください。</li>
	<li>次の式を使用して計算を実行します。 C[LUV] (モル / l) = (OD サンプル / OD 標準) x C[標準] (モル / l) 注:リン脂質定量キットは、C[標準]=3.87 mmol/L.ODサンプルおよびOD標準のモル濃度に対応する54mg/dLのコリンクロライド(139.6 mg/l)標準溶液を提供し、それぞれLUVおよびコリン溶液の吸光度を600nmで測定した。</li>
</ol>4. LUVサイズと均質性の特性
<ol><li>LUV サイズ (nm) と多分散インデックス (PdI) を決定するために、DLS 計測器を使用して測定を実行します。</li>
	<li>溶媒/バッファーおよび使用済キュベットの粘度を示すことによって、適切な「標準操作手順」(SOP)をプログラムします。</li>
	<li>500 μL の LUV 溶液をポリスチレンセミマイクロキュベットに入れる。</li>
	<li>DLS装置にポリスチレンセミマイクロキュベットを挿入します。</li>
	<li>室温では、粒子分布と均質性(多分散指数、PdI)の平均サイズ(Z平均)の観点からサイズ分布を測定する。</li>
	<li>すべての結果は、3つの繰り返しサイクルでそれぞれ実行される2つの独立した測定から得られます。 注: LUV の標準値は、0.149 ± 0.041 の PdI で 137 ± 7 nm の平均サイズになります。</li>
</ol>5. ペプチド溶液の調製
<ol><li>漏れアッセイのために分析されるべきペプチドのストック溶液を準備する。</li>
	<li>ペプチド粉末(>純度>)を純水(例えば、純水500μLで1mgのペプチド)に溶解します。 注:ペプチドを純水中で希釈し、ジメチルスルホキシド(DMSO)の可溶化を避けることを推奨し、人工物を誘導する可能性があります(例えば、膜透過20)。</li>
	<li>5 sのペプチド溶液をボルテックスする。</li>
	<li>5分間水超音波浴でペプチド溶液を超音波処理し、12,225 x gで5分間遠心分離します。濃度決定のために上清を収集します。</li>
	<li>3つの独立したペプチド希釈液の280 nmで吸光度を測定し、そのモル絶滅係数ε(ペプチド配列中のトリプトファンおよびチロシン含有量に依存する)およびビール・ランバート規則を用いてペプチド濃度を計算します。 注:ペプチドにトリプトファンおよびチロシンが含まれている場合、εモル絶滅係数はトリプトファンε= 5,690 M-1cm-1、チロシンε= 1,280 M -1 cm-1に基づいて計算されます。ペプチド配列にトリプトファンまたはチロシンが含まなければ、他の着色アッセイを行って濃度を測定することができます(例えば、BCAまたはブラッドフォード)。</li>
	<li>純水でペプチド溶液を希釈し、最終溶液100μMにし、4°Cで保存します。 注:純水では、4°Cの保存中にペプチド分解は起こりません。しかし、水の蒸発が起こらないように、2週間ごとにペプチド濃度を測定する必要があります。</li>
</ol>6. 蛍光漏れ測定
<ol><li>蛍光漏れ測定は、室温の分光蛍光計で測定されます。励起波長および発光波長はEx= 360 nm ±3 nm、Em = 530 nm ± 5 nm でそれぞれ 5 nm に固定されています。</li>
	<li>1 mL HEPES バッファー 2 の LUV を、水晶蛍光キュベットで 100 μM の最終濃度に希釈します。磁気攪拌機を加えて、実験中に溶液を均質化します。</li>
	<li>バックグラウンド蛍光にアクセスするには、最初の100 s(t = 0 sとt = 99 sの間)で単独でLUVを測定します。 注: RV 単独は、バックグラウンドの蛍光と潜在的なリークにアクセスするために、実験全体(15 分)の間に測定することもできます。</li>
	<li>その後、次の900s(15分)に対するペプチド溶液のアリコートを添加した際の蛍光強度の増加として漏れを測定する。このプロトコルは、0.1 μMから2.5 μMまで試験したペプチドの濃度ごとに実行されます。</li>
	<li>最後に、トリトンX-100(0.1%、v/v)の1μLを加えてLUVを可溶化することで100%蛍光を得て、t= 1,000 sとt=1,100sの間で完全に消し止められていないプローブを得ました。</li>
</ol>7. 漏出の定量化
<ol><li>テストされた各条件で同じポイント数を維持するために、t = 1,090 s の後に取得された値を抑制します。</li>
	<li>最小蛍光 F分を計算するには、t = 0 s と t = 49 s (LUV 単体) の間の平均 50 ポイントを作成します。</li>
	<li>t = 1,041 s と t = 1,090 s (Triton X-100 を持つ LUV) の間の平均 50 ポイントを作ることによって、最大蛍光 Fmaxを計算します。</li>
	<li>次の式に従って、各時点(t = x)における漏れ率(%リーク)を計算します。 %リーク(t=x) = (F(t=x) - F最小) / (F最大 - F最小値) x 100</li>
	<li>同じ条件に対して異なる LUV 準備 (n ≥ 2) で取得された値の平均と標準偏差を計算します。</li>
	<li>時間の関数で漏れ率%リーク(t=x)をプロットします。</li>
</ol>

<ol>
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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+peptide+translocation+into+large+unilamellar+vesicles.">Measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3571 (2012).</li><li>Wimley, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+effects+of+membrane-interacting+peptides+on+membrane+integrity.">Determining the effects of membrane-interacting peptides on membrane integrity.</a> Cell-Penetrating Peptides. 1324, 89-106 (2015).</li><li>B&#225;r&#225;ny-Wallje, E., Gaur, J., Lundberg, P., Langel, U., Gr&#228;slund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+membrane+perturbation+caused+by+the+cell+penetrating+peptide+Tp10+depending+on+attached+cargo.">Differential membrane perturbation caused by the cell penetrating peptide Tp10 depending on attached cargo.</a> FEBS Letters. 581 (13), 2389-2393 (2007).</li><li>van Rooijen, B. D., Claessens, M. M. A. E., Subramaniam, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+permeabilization+by+oligomeric+&#945;-Synuclein:+in+search+of+the+mechanism.">Membrane permeabilization by oligomeric &#945;-Synuclein: in search of the mechanism.</a> PloS One. 5 (12), 14292 (2010).</li><li>Hassane, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+cellular+trafficking+of+splice+redirecting+oligonucleotides+complexed+with+chemically+modified+cell-penetrating+peptides.">Insights into the cellular trafficking of splice redirecting oligonucleotides complexed with chemically modified cell-penetrating peptides.</a> Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 153 (2), 163-172 (2011).</li><li>Asciolla, J. J., Renault, T. T., Chipuk, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examining+BCL-2+family+function+with+large+unilamellar+vesicles.">Examining BCL-2 family function with large unilamellar vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e4291 (2012).</li><li>Grewer, C., Gameiro, A., Mager, T., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+characterization+of+membrane+transport+proteins.">Electrophysiological characterization of membrane transport proteins.</a> Annual Review of Biophysics. 42 (1), 95-120 (2013).</li></ol>

著者には利益相反はありません。

提示された蛍光漏れアッセイは、細胞透過性ペプチドによる膜不安定化に対処するための簡単で迅速な方法です。容易に行うと、それはまた、異なる膜相互作用ペプチドまたは他の膜相互作用分子間の間接的な比較を可能にする。プロトコルの重要なステップに関しては、このアッセイはベースライン(LUV単独)と最大蛍光放出(トリトン条件)の間の相対的な値を提供するので、通常、我々は、...

90年代に発見された後、細胞透過性ペプチド(CpP)は、原形質膜1,2を介した貨物の効率的な細胞送達を促進するために開発された。CpPは、通常、短いペプチド、一般的に8〜30個のアミノ酸、多種多様な起源を有する。彼らは最初に「直接転位」キャリアとして定義され、細胞膜を横断し、エネルギー要件も受容体関与も含み無い任意のエンドサイトー状態経路とは無関係に細胞に貨物を移すことができたことを意味する。しかし、さらなる調査は、これらの最初の観測は、主に、実験用アーティファクトおよび/またはメタノール3を用いた固定プロトコルによる蛍光過大評価から来たことを明らかにした。今日では、CPPの取り込みは、貨物の性質、CPPと貨物の間の使用リンク、研究されたセルラインなどの異なるパラメータに応じて、エンドサイトーシスとエネルギー独立転座4、5、6、7の両方で行われることが広く受け入れられています。
CpPは、CPPとその貨物8、9、10、11との間の化学的リンク(共有戦略)または静電/疎水性相互作用(非共有性戦略)を含む2つの戦略に従ってトランスフェクション剤として使用することができる。両方の戦略は、いくつかの貨物の細胞移動における効率を示しているが、CCPによる内在化のメカニズムの理解は依然として論争の下にあり、エンドサイトーシス経路または直接浸透間のバランスは12,13を測定することは依然として困難である。一連の実験ツールと戦略は、エンドサイトのプロセスの関与に明確に対処するために利用可能であるが、直接転位は、しかし、それは形質膜成分とのより離散的な相互作用を意味するので、より特徴付けが難しいようです。生体膜は通常、リン脂質から膜タンパク質まで、細胞の種類や環境(ストレス条件、細胞分裂など)によって異なる多くの成分で構成されています。この組成物の多様性、そして結果的に普遍的な細胞膜モデルの欠如は、単一の方法での研究を可能にしません。しかし、これらの限界を回避するために、ステップバイステップのアプローチは、人工膜または膜抽出物で開発された。小さな単層小胞から単層のアプローチまで、すべてのモデルは明らかに特定の質問14、15に答えるために関連していた。中でも、大きな単層小胞(RV)は、ペプチド/膜相互作用を内部化プロセスの重要なポイントとして研究するための適切な膜模倣モデルを構成しています。
この文脈において、以下のプロトコルは、陰イオン蛍光色素とリポソームに封入された対応するポリカチオンクエンチャーの両方のモニタリングを通じて、ペプチドおよびペプチド/膜相互作用がLUVの完全性に及ぼす影響の調査を記述する。このツールは、直接膜転座を行うことができるかどうかを理解するために、CPP/膜相互作用を研究するために使用されます。通常は異なる膜相互作用ペプチドを比較するために適用されますが、このLUV蛍光漏れアッセイは、CpPs-貨物コンジュゲート(共有戦略)とCPP:貨物複合体(非共有戦略)の両方を調査するためにも使用できます。
本プロトコルは、最近開発されたトリプトファン(W)とアルギニン(R)が豊富な媒性ペプチド(WRAP)16で最初に例示される。WRAPは、ペプチドベースのナノ粒子を形成し、いくつかの細胞株16において小さな干渉RNA(siRNA)を迅速かつ効率的に送達することができる。WRAPペプチド単独またはsiRNA搭載WRAPベースナノ粒子の蛍光漏れ特性をモニタリングし、細胞内在化のメカニズムを特徴付けた。我々は、内部化のメカニズムが主に直接転座7を含むことを示した。第2の例では、WRAPペプチドをタンパク質/タンパク質干渉ペプチドiCAL36(WRAP-iCAL36)17に共有結合し、膜を不安定化させる能力を、penetratin 18(Penetratin-iCAL36)と結合したiCAL36に対する蛍光漏れアッセイで比較した。
最後に、この方法の利点と限界は、技術的な観点から、生物学的関連性に関して議論される。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >25 mL glass round-bottom flask</td>
			<td >Pyrex</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >8-aminonaphthalene-1, 3, 6-trisulfonic acid, disodium salt (ANTS)</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A350</td>
			<td>Protect from light&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform&#160;</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >288306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cholesterol</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DOPC (dioleoylphosphatidylcholine)</td>
			<td >Avanti Polar</td>
			<td>850375P</td>
			<td>Protect from air</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Extruder</td>
			<td >Avanti Polar</td>
			<td >610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluorimeter</td>
			<td >PTI Serlabo</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 &#181;L glass syringe</td>
			<td >Hamilton</td>
			<td >705N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LabAssay Phospholipid&#160;</td>
			<td >WAKO&#160;</td>
			<td >296-63801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >liquid chromatography column</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methanol</td>
			<td >Carlo Erba</td>
			<td >414902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nuclepore polycarbonate membrane (0.1 &#181;m pore size, 25 mm diameter)</td>
			<td >Whatman</td>
			<td >800309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >polystyrene cuvette, 10 x 10 x 45 mm</td>
			<td >Grener Bio-One</td>
			<td >614101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >polystyrene semi-micro cuvette, DLS</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >FB55924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >p-xylene-bispyridinium bromide (DPX)</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >X1525</td>
			<td>Protect from light&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >quartz fluorescence cuvette</td>
			<td >Hellma</td>
			<td >109.004F-QS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >rotavapor system&#160;</td>
			<td >Heidolph</td>
			<td >Z334898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sephadex G-50 resin</td>
			<td >Amersham</td>
			<td >17-0042-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium azide (NaN3)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium chlorid (NaCl)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sonicator bath USC300T</td>
			<td >VWR</td>
			<td >142-6001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sphingomyelin</td>
			<td >Avanti Polar</td>
			<td>860062P</td>
			<td>Protect from air</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100&#160;</td>
			<td >Eromedex</td>
			<td >2000-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Zetaziser NanoZS&#160;</td>
			<td >Malvern</td>
			<td >ZEN3500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescent leakage assay to investigate membrane destabilization by cell-penetrating peptide

細胞貫通性ペプチド(CpP)は、細胞膜を横断し、細胞に貨物を移動することができるキャリアとして定義されます。この活性に必要な主な共通の特徴の1つは、CCPと血漿膜(脂質)の相互作用、特に膜自体の細胞外マトリックス(ヘパラン硫酸塩)の成分との相互作用から生じる。実際、直接転位またはエンドサイトーシス依存の内在化とは無関係に、脂質二重層は、細胞膜のレベルと細胞内トラフィック(内皮小胞)のレベルの両方で内在化プロセスに関与している。本稿では、蛍光漏れ測定法における大ユニラメラ小胞(LUV)製剤の様々なステップを説明する詳細なプロトコルを紹介し、CPP膜不安定化/相互作用の可能性を検出し、内部化メカニズムにおけるそれらの役割に対処する。細胞膜含量を反映した脂質組成物を有するRVは、蛍光色素とクエンチャーの両方を封入するために生成される。また、発光培地にペプチドを添加し、また、LUV上でのペプチド膜相互作用の誘導は、このように、蛍光の有意な増加を漏出を明らかにする用量依存的に誘導する可能性がある。例は、最近開発されたトリプトファン(W)-およびアルギニン(R)が豊富なアンフィパシーペプチド(WrAP)を備えており、様々な細胞株における迅速かつ効率的なsiRNA送達を示した。最後に、これらの相互作用の性質と脂質に対する親和性を理解し、膜転座および/または内膜脱出を改善するために議論される。

蛍光漏れ測定の原理を 図1に示す。詳細には、蛍光色素とクエンチャー(蛍光シグナルなし)をカプセル化した大きなユニラメラ小胞(RV)を、目的の生体分子で処理します。脂質膜とのペプチドの相互作用により、膜透過性、再編成、あるいは破裂を意味する可能性があるため、蛍光色素およびクエンチャーは、RVから放出される。バッファー内のそ...

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Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide

蛍光漏れアッセイは、ペプチド/膜相互作用の調査を可能にする簡単な方法であり、いくつかの生物学的プロセスへの関与、特に細胞内転位プロセス中に細胞透過性ペプチドが二重層のリン脂質を乱す能力を理解する。

細胞透過性ペプチドによる膜不安定化を調べる蛍光漏れアッセイ

Cell-penetrating peptides (CPPs) are defined as carriers that are able to cross the plasma membrane and to transfer a cargo into cells. One of the main ...

fluorescent-leakage-assay-to-investigate-membrane-destabilization

Research

JoVE Journal

Biochemistry

6.1K ビュー.  INSERM U1046 - CNRS UMR 9214 - University of Montpellier. 蛍光漏れアッセイは、ペプチド/膜相互作用の調査を可能にする簡単な方法であり、いくつかの生物学的プロセスへの関与、特に細胞内転位プロセス中に細胞透過性ペプチドが二重層のリン脂質を乱す能力を理解する。

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Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a determinant phosphoinositide of the plasma membrane (PM), and it is required to modulate ion channels, actin dynamics, exocytosis, endocytosis, intracellular signaling, and many other cellular processes. However, the spatial organization of PI(4,5)P2 in the PM is controversial, and its nanoscale distribution is poorly understood due to the technical limitations of research approaches. Here by utilizing single molecule localization microscopy and the Pleckstrin Homology (PH) domain based dual color fluorescent probes, we describe a novel method to visualize the nanoscale distribution of PI(4,5)P2 in the PM in fixed membrane sheets as well as live cells.

PI(4,5)P2 regulates various cellular functions, but its nanoscale organization in the cell plasma membrane is poorly understood. By labeling PI(4,5)P2 with a dual-color fluorescent probe fused to the Pleckstrin Homology domain, we describe a novel approach to study the PI(4,5)P2 spatial distribution in the plasma membrane at the nanometer scale.

新規蛍光プローブと形質膜におけるホスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸の単分子超解像イメージング

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

生化学

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

足場リポソームを使用することにより、脂質近位タンパク質 - タンパク質相互作用を再構成します<em&gt;インビトロ</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

透過型電子顕微鏡により膜相互作用タンパク質を視覚化し、分析するための方法

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field of 3D templates is rising due to the potential resemblance of those materials to the natural extracellular matrix. Protein-based hydrogels are particularly promising because they can easily be functionalized and can achieve defined structures with adjustable physicochemical properties. However, the production of macroporous 3D templates for cell culture applications using natural materials is often limited by their weaker mechanical properties compared to those of synthetic materials. Here, different methods were evaluated to produce macroporous bovine serum albumin (BSA)-based hydrogel systems, with adjustable pore sizes in the range of 10 to 70 &#181;m in radius. Furthermore, a method to generate channels in this protein-based material that are several hundred microns long was established. The different methods to produce pores, as well as the influence of pore size on material properties such as swelling ratio, pH, temperature stability, and enzymatic degradation behavior, were analyzed. Pore sizes were investigated in the native, swollen state of the hydrogels using confocal laser scanning microscopy. The feasibility for cell culture applications was evaluated using a cell-adhesive RGD peptide modification of the protein system and two model cell lines: human breast cancer cells (A549) and adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells (MCF7).

Different methods to manipulate three-dimensional architecture in protein-based hydrogels are evaluated here with respect to material properties. The macroporous networks are functionalized with a cell-adhesive peptide, and their feasibility in cell culture is evaluated using two different model cell lines.

細胞培養用ヒドロゲルの蛋白質ベースのアーキテクチャの簡単な操作

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis can be characterized using an in vitro DNA synthesis assay followed by polyacrylamide gel electrophoresis. The goal of this assay is to quantify synthesis of both natural DNA and modified DNA (M-DNA). These approaches are particularly useful for resolving oligonucleotides with single nucleotide resolution, enabling observation of individual steps during enzymatic oligonucleotide synthesis. These methods have been applied to the evaluation of an array of biochemical and biophysical properties such as the measurement of steady-state rate constants of individual steps of DNA synthesis, the error rate of DNA synthesis, and DNA binding affinity. By using modified components including, but not limited to, modified nucleoside triphosphates (NTP), M-DNA, and/or mutant DNA polymerases, the relative utility of substrate-DNA polymerase pairs can be effectively evaluated. Here, we detail the assay itself, including the changes that must be made to accommodate nontraditional primer DNA labeling strategies such as near-infrared fluorescently labeled DNA. Additionally, we have detailed crucial technical steps for acrylamide gel pouring and running, which can often be technically challenging.

This protocol describes the characterization of DNA polymerase synthesis of modified DNA through observation of changes to near-infrared fluorescently labeled DNA using gel electrophoresis and gel imaging. Acrylamide gels are used for high resolution imaging of the separation of short nucleic acids, which migrate at different rates depending on size.

アクリルアミドゲル電気泳動法で可視化した近赤外蛍光標識 DNA を用いた DNA ポリメラーゼ活性測定法

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The modification presented includes the combination of this technique with cell-penetrating sequences. We propose to design cell-penetrating baits that can be incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions found will reflect those that occur within the intracellular context. Connexin43 (Cx43), a protein that forms gap junction channels and hemichannels is down-regulated in high-grade gliomas. The Cx43 region comprising amino acids 266-283 is responsible for the inhibition of the oncogenic activity of c-Src in glioma cells. Here we use TAT as the cell-penetrating sequence, biotin as the pull-down tag and the region of Cx43 comprised between amino acids 266-283 as the target to find intracellular interactions in the hard-to-transfect human glioma stem cells. One of the limitations of the proposed method is that the molecule used as bait could fail to fold properly and, consequently, the interactions found could not be associated with the effect. However, this method can be especially interesting for the interactions involved in signal transduction pathways because they are usually carried out by intrinsically disordered regions and, therefore, they do not require an ordered folding. In addition, one of the advantages of the proposed method is that the relevance of each residue on the interaction can be easily studied. This is a modular system; therefore, other cell-penetrating sequences, other tags, and other intracellular targets can be employed. Finally, the scope of this protocol is far beyond protein-protein interaction because this system can be applied to other bioactive cargoes such as RNA sequences, nanoparticles, viruses or any molecule that can be transduced with cell-penetrating sequences and fused to pull-down tags to study their intracellular mechanism of action.

This is a protocol to study intracellular protein-protein interactions based on the biotin-avidin pull-down system with the novelty of combining cell-penetrating sequences. The main advantage is that the target sequence is incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions will occur within the cellular context.

細胞内タンパク質間相互作用を研究するビオチン化セル透過ペプチド

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage by extracellular oxidants. This process of transporting electrons from intracellular reductants to extracellular oxidants is not well defined. Here we present spectrophotometric assays by C2C12 myotubes to monitor tPMET utilizing the extracellular electron acceptors: water-soluble tetrazolium salt-1 (WST-1) and 2,6-dichlorophenolindophenol (DPIP or DCIP). Through reduction of these electron acceptors, we are able to monitor this process in a real-time analysis. With the addition of enzymes such as ascorbate oxidase (AO) and superoxide dismutase (SOD) to the assays, we can determine which portion of tPMET is due to ascorbate export or superoxide production, respectively. While WST-1 was shown to produce stable results with low background, DPIP was able to be re-oxidized after the addition of AO and SOD, which was demonstrated with spectrophotometric analysis. This method demonstrates a real-time, multi-well, quick spectrophotometric assay with advantages over other methods used to monitor tPMET, such as ferricyanide (FeCN) and ferricytochrome c reduction.

The goal of this protocol is to spectrophotometrically monitor trans-plasma membrane electron transport utilizing extracellular electron acceptors and to analyze enzymatic interactions that may occur with these extracellular electron acceptors.

C2C12 細胞によるトランス プラズマ膜電子輸送特性の測定

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

細胞間の接触でタンパク質間相互作用の分析計蛍光の変動

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often viruses exhibit cell and tissue tropism and are adapted to specific cell or tissue proteases. Moreover, these viruses can introduce mutations or insertions into their genome during replication that may affect the cleavage, and thus can contribute to adaptations to a new host. Here, we present a fluorogenic peptide cleavage assay that allows a rapid screening of peptides mimicking the cleavage site of viral fusion proteins. The technique is very flexible and can be used to investigate the proteolytic activity of a single protease on many different substrates, and in addition, it also allows exploration of the activity of multiple proteases on one or more peptide substrates. In this study, we used peptides mimicking the cleavage site motifs of the coronavirus spike protein. We tested human and camel derived Middle East Respiratory Syndrome coronaviruses (MERS-CoV) to demonstrate that single and double substitutions in the cleavage site can alter the activity of furin and dramatically change cleavage efficiency. We also used this method in combination with bioinformatics to test furin cleavage activity of feline coronavirus spike proteins from different serotypes and strains. This peptide-based method is less labor- and time intensive than conventional methods used for the analysis of proteolytic activity for viruses, and results can be obtained within a single day.

We present a fluorogenic peptide cleavage assay that allows a rapid screening of the proteolytic activity of proteases on peptides representing the cleavage site of viral fusion peptides. This method can also be used on any other amino acid motif within a protein sequence to test for the protease activity.

プロテアーゼ活性の画面に蛍光ペプチド胸の谷間アッセイ: アプリケーション コロナ ウイルスのスパイク蛋白質のアクティブ化

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used for ATP production. The amphiphilic nature of membrane proteins requires particular attention to their handling, and reconstitution into the natural lipid environment is indispensable when studying membrane transport processes like proton translocation. Here, we detail a method that has been used for the investigation of the proton-pumping mechanism of membrane redox enzymes, taking cytochrome bo3 from Escherichia coli as an example. A combination of electrochemistry and fluorescence microscopy is used to control the redox state of the quinone pool and monitor pH changes in the lumen. Due to the spatial resolution of fluorescent microscopy, hundreds of liposomes can be measured simultaneously while the enzyme content can be scaled down to a single enzyme or transporter per liposome. The respective single enzyme analysis can reveal patterns in the enzyme functional dynamics that might be otherwise hidden by the behavior of the whole population. We include a description of a script for automated image analysis.

Here, we present a protocol to study the molecular mechanism of proton translocation across lipid membranes of single liposomes, using cytochrome bo3 as an example. Combining electrochemistry and fluorescence microscopy, pH changes in the lumen of single vesicles, containing single or multiple enzyme, can be detected and analyzed individually.

電気化学と蛍光顕微鏡を用いたプロトン ポンプ膜酵素の研究のための単一リポソーム測定

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...