Name: fluorescent leakage assay to investigate membrane destabilization by cell-penetrating peptide
Uploaded: 2020-12-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
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著者たちは、エミリー・ジョッセが原稿の批判的なレビューに感謝したいと思います。この作品は、財団「ラ・リーグ・コントル・ル・ガン」「フォンダシオンARCはラ・レシェルシュ・シュル・ル・ガンを注ぐ」、そして「センター・ナショナル・デ・ラ・レシェルシュ・サイエンティフィック」(CNRS)によって支えられました。

1. 大型ユニラメラベシクル(RV)の調製
<ol><li>蛍光漏れ測定のための細胞膜模倣として使用するためのLUVを準備します。</li>
	<li>ハミルトンガラス注射器ホスファチジルコリン(DOPC、786.11 g/mol)、スフィンゴミエリン(SM、760.22 g/mol)、コレステロール(Chol、386.65 g/mol)をモル比4:4:2で混ぜます。脂質溶液は、25 mLガラス丸底フラスコで25mg/mLのメタノール/クロロホルム(3/1;体積/体積)溶媒で可溶化した各脂質のストック溶液から得られます。4 μmolの DOPC、4 μmol SM、および 2 μmol の Chol に基づいて、脂質溶液は、それぞれ 126 μL、117 μL、および 31 μL を混合してストック溶液から得られます。 注意:メタノールは有毒で可燃性の溶媒であり、クロロホルムは有毒で発がん性があります。どちらもフードの下で適切な保護で処理する必要があります。</li>
	<li>乾燥した脂質膜の形成まで60°Cで45〜60分の真空下でロータリーエバポレーターを使用してメタノール/クロロホルムを蒸発させます。</li>
	<li>2つのストックHEPESバッファソリューションを準備します。HEPES バッファー 1 を 20 mM HEPES (238.3 g/mol) と 75 mM NaCl (58.44 g/mol) を混合して準備し、pH を 7.4 に調整します。20 mM HEPES と 145 mM NaCl を混合して HEPES バッファー 2 を準備し、pH を 7.4 に調整します。HEPESバッファーは、4°Cで1ヶ月間保存することができます。 メモ:オスマメーターを使用してバッファの浸透圧を確認することをお勧めします。</li>
	<li>膜不浸透性蛍光色素クエンチャーカップル、8-アミノナフタレン-1、3、6-トリスルホン酸、12.5mM(ANTS、427.33 g/mol)の二ナトリウム塩、45 mM(DPX、422.16)の臭化液中にp-キシレンバイスピリジウム臭化物を溶解して脂質水和液を調製する。DPXとアリを混合すると、黄色の溶液が出ます。12.5 mMのANTSと45 mMのDPXの濃度を達成するために、HEPESバッファー1の4 mLにそれぞれ21.4mgおよび76mgを溶解する。 注:脂質ハイドレーション溶液は、チューブをアルミホイルで包むことで4°Cで2週間保存することができます。</li>
	<li>リコンセシスマルチラメラ小胞(MLV)は、乾燥した脂質水和溶液の1mLで乾燥した脂質膜を再懸濁し、乾燥した脂質膜を溶解するまでボルテックスすることにより行う。小さな脂質凝集体が前のステップに悪影響を及ぼすため、溶液が完全に可溶化していることを確認してください。また、ガラス丸底フラスコの壁面を確認して、残っている脂質フィルムがないことを確認します。 注: 溶液は可溶化後に青白色と淡黄色で表示されます。</li>
	<li>小胞を5回凍結/解凍サイクルにして、単層小胞を得る。凍結ステップのために液体窒素に30sのガラス丸底フラスコを入れて、解凍ステップのために2分間水浴に残すことによって、各サイクルを実行します。 注:浴水の温度は、脂質の溶融温度よりも5〜10°C高くする必要があります。</li>
	<li>2つのフィルターを挿入して脂質押出機を準備し、各ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)押出機片にHEPESバッファーを用いて予備加湿をサポートし、金属押出機キャニスターに入れ加工する。</li>
	<li>1つのフィルターサポートの上部にHEPES加湿ポリカーボネート膜(0.1 μmの細孔サイズ、直径25mm)を入れます。</li>
	<li>2つの金属押出機キャニスターを組み立て、ねじ込みます。</li>
	<li>組み立てた押出機をホルダーに入れ、各ポリテトラフルオロエチレン押出機片の先端部に適当な穴に1mLシリンジを導入します。押出は、ポリカーボネート膜を通して一方のシリンジから他方への検査された液体の通過に相当する。</li>
	<li>1 mL シリンジの 1 つに HEPES バッファーを 1 mL ロードして押出機をテストし、漏れや問題がないことを確認します。</li>
	<li>1 mL HEPES バッファーを MLV サンプルに交換します。</li>
	<li>MLVサンプルを一方のシリンジから他方のシリンジに少なくとも21回通し、同じサイズの均一なRVを得ることによって押出を行う。 注:押出は、脂質混合物の溶融温度よりも高い温度で行われるべきです。</li>
</ol>2. ルブの浄化
<ol><li>非カプセル化されたANTSおよびDPX過剰を除去するためにカラム精製を準備する。</li>
	<li>液体クロマトグラフィーカラム(ルアーロック、ノンジャケット、1.0cm x 20cm、ベッド容積16mL)に0.01%NaN 3(65g/mol)を含む水媒体に再懸濁された架橋デキストランゲル(G-50)を、無色部分の上部から1cm下に1cm下に導入します。</li>
	<li>タップを開き、液体を流して架橋ドキストランゲルを落ち着かせる。</li>
	<li>20mLのHEPESバッファー2で溶出してカラムを洗浄し、カラムの出力フローを廃棄します。</li>
	<li>カラム上の溶媒のデッドボリュームが最小になったら(<100 μL)、架橋ドキストランゲルの乾燥を避けるために十分な後にタップを閉じます。</li>
	<li>押し出したてのSUV(黄色)をコラムに置き、架橋されたデキストランゲルに入ります。</li>
	<li>列にHEPESバッファー2を連続的に加え、LUV精製を行う。</li>
	<li>約2mLのHEPES緩衝液2(架橋ドキストランゲルの乾燥を避けるためにカラムの上部を定期的に充填することを忘れないでください):フリーイエローANTSおよびDPX溶液はリポソームよりも遅く移行します。</li>
	<li>チューブ(1.5 mL)内の精製されたLUVの収集を開始します。</li>
	<li>カラムからの溶離液の滴を観察し、それらが乳白色になると、リポソームが含まれています。チューブを変更して、LUV含有分率を回復します。</li>
	<li>滴がもはや青白色(〜1 mL)になるまでエルテ。その後、別の分数で別の0.5 mLを溶出し、溶出を停止します。 注: キットや個々の分子量として、UV の溶出量を校正するために、幅広い分子量で規格が利用可能になりました。</li>
	<li>蛍光色素の漂白を避けるために、チューブをアルミニウム箔でチューブに包みます。</li>
	<li>20 mL HEPES バッファー 2 でカラムを洗います。</li>
	<li>その後、RVは4°Cで1週間保存することができます。 注意:LUVの安定性は、LUVの濃度と構成、およびイオン強度に依存する可能性があるため、LUVのサイズはダイナミック光散乱(DLS)機器を使用して制御する必要があります(セクション4を参照してください。各テストの前に、LUV サイズと同質性の特性を示します。</li>
</ol>3. LUV の濃度を定量化する
<ol><li>リン脂質定量キットによるLUV濃度を推定し、コリン濃度19の評価を可能にする。このアッセイは、極性頭部を含むコリンを含むリン脂質が実質的である場合に適用される可能性があります(rvvの>50%)。</li>
	<li>18mgのクロモーゲン基質を3mLのバッファーに溶解して色試薬を調製する。</li>
	<li>ポリスチレンキュベットをロード, 10 x 10 x 45 mm, 色試薬の 3 mL.</li>
	<li>純色試薬をブランク条件(ブランク)として使用してください。LUVサンプル(テスト)または既知のコリン濃度の標準溶液の20 μLを追加します(標準)。</li>
	<li>よく混ぜ、37 °Cのすべての条件(ブランク、テスト、および標準)で5分間インキュベートします。</li>
	<li>試験試料の吸光度(光学密度、OD)を測定し、スペクトロフォトメーターで600nmでコントロールするブランク溶液を用いて標準溶液を測定します。</li>
	<li>既知の濃度の標準と比較して、コリン相当のRVの脂質濃度を推定することを可能にするOD値をチェックしてください。</li>
	<li>次の式を使用して計算を実行します。 C[LUV] (モル / l) = (OD サンプル / OD 標準) x C[標準] (モル / l) 注:リン脂質定量キットは、C[標準]=3.87 mmol/L.ODサンプルおよびOD標準のモル濃度に対応する54mg/dLのコリンクロライド(139.6 mg/l)標準溶液を提供し、それぞれLUVおよびコリン溶液の吸光度を600nmで測定した。</li>
</ol>4. LUVサイズと均質性の特性
<ol><li>LUV サイズ (nm) と多分散インデックス (PdI) を決定するために、DLS 計測器を使用して測定を実行します。</li>
	<li>溶媒/バッファーおよび使用済キュベットの粘度を示すことによって、適切な「標準操作手順」(SOP)をプログラムします。</li>
	<li>500 μL の LUV 溶液をポリスチレンセミマイクロキュベットに入れる。</li>
	<li>DLS装置にポリスチレンセミマイクロキュベットを挿入します。</li>
	<li>室温では、粒子分布と均質性(多分散指数、PdI)の平均サイズ(Z平均)の観点からサイズ分布を測定する。</li>
	<li>すべての結果は、3つの繰り返しサイクルでそれぞれ実行される2つの独立した測定から得られます。 注: LUV の標準値は、0.149 ± 0.041 の PdI で 137 ± 7 nm の平均サイズになります。</li>
</ol>5. ペプチド溶液の調製
<ol><li>漏れアッセイのために分析されるべきペプチドのストック溶液を準備する。</li>
	<li>ペプチド粉末(>純度>)を純水(例えば、純水500μLで1mgのペプチド)に溶解します。 注:ペプチドを純水中で希釈し、ジメチルスルホキシド(DMSO)の可溶化を避けることを推奨し、人工物を誘導する可能性があります(例えば、膜透過20)。</li>
	<li>5 sのペプチド溶液をボルテックスする。</li>
	<li>5分間水超音波浴でペプチド溶液を超音波処理し、12,225 x gで5分間遠心分離します。濃度決定のために上清を収集します。</li>
	<li>3つの独立したペプチド希釈液の280 nmで吸光度を測定し、そのモル絶滅係数ε(ペプチド配列中のトリプトファンおよびチロシン含有量に依存する)およびビール・ランバート規則を用いてペプチド濃度を計算します。 注:ペプチドにトリプトファンおよびチロシンが含まれている場合、εモル絶滅係数はトリプトファンε= 5,690 M-1cm-1、チロシンε= 1,280 M -1 cm-1に基づいて計算されます。ペプチド配列にトリプトファンまたはチロシンが含まなければ、他の着色アッセイを行って濃度を測定することができます(例えば、BCAまたはブラッドフォード)。</li>
	<li>純水でペプチド溶液を希釈し、最終溶液100μMにし、4°Cで保存します。 注:純水では、4°Cの保存中にペプチド分解は起こりません。しかし、水の蒸発が起こらないように、2週間ごとにペプチド濃度を測定する必要があります。</li>
</ol>6. 蛍光漏れ測定
<ol><li>蛍光漏れ測定は、室温の分光蛍光計で測定されます。励起波長および発光波長はEx= 360 nm ±3 nm、Em = 530 nm ± 5 nm でそれぞれ 5 nm に固定されています。</li>
	<li>1 mL HEPES バッファー 2 の LUV を、水晶蛍光キュベットで 100 μM の最終濃度に希釈します。磁気攪拌機を加えて、実験中に溶液を均質化します。</li>
	<li>バックグラウンド蛍光にアクセスするには、最初の100 s(t = 0 sとt = 99 sの間)で単独でLUVを測定します。 注: RV 単独は、バックグラウンドの蛍光と潜在的なリークにアクセスするために、実験全体(15 分)の間に測定することもできます。</li>
	<li>その後、次の900s(15分)に対するペプチド溶液のアリコートを添加した際の蛍光強度の増加として漏れを測定する。このプロトコルは、0.1 μMから2.5 μMまで試験したペプチドの濃度ごとに実行されます。</li>
	<li>最後に、トリトンX-100(0.1%、v/v)の1μLを加えてLUVを可溶化することで100%蛍光を得て、t= 1,000 sとt=1,100sの間で完全に消し止められていないプローブを得ました。</li>
</ol>7. 漏出の定量化
<ol><li>テストされた各条件で同じポイント数を維持するために、t = 1,090 s の後に取得された値を抑制します。</li>
	<li>最小蛍光 F分を計算するには、t = 0 s と t = 49 s (LUV 単体) の間の平均 50 ポイントを作成します。</li>
	<li>t = 1,041 s と t = 1,090 s (Triton X-100 を持つ LUV) の間の平均 50 ポイントを作ることによって、最大蛍光 Fmaxを計算します。</li>
	<li>次の式に従って、各時点(t = x)における漏れ率(%リーク)を計算します。 %リーク(t=x) = (F(t=x) - F最小) / (F最大 - F最小値) x 100</li>
	<li>同じ条件に対して異なる LUV 準備 (n ≥ 2) で取得された値の平均と標準偏差を計算します。</li>
	<li>時間の関数で漏れ率%リーク(t=x)をプロットします。</li>
</ol>

<ol>
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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorus+assay+in+column+chromatography.">Phosphorus assay in column chromatography.</a> Journal of Biological Chemistry. 234 (3), 466-468 (1959).</li><li>Stewart, J. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+determination+of+phospholipids+with+ammonium+ferrothiocyanate.">Colorimetric determination of phospholipids with ammonium ferrothiocyanate.</a> Analytical Biochemistry. 104 (1), 10-14 (1980).</li><li>Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+peptide+translocation+into+large+unilamellar+vesicles.">Measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3571 (2012).</li><li>Wimley, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+effects+of+membrane-interacting+peptides+on+membrane+integrity.">Determining the effects of membrane-interacting peptides on membrane integrity.</a> Cell-Penetrating Peptides. 1324, 89-106 (2015).</li><li>B&#225;r&#225;ny-Wallje, E., Gaur, J., Lundberg, P., Langel, U., Gr&#228;slund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+membrane+perturbation+caused+by+the+cell+penetrating+peptide+Tp10+depending+on+attached+cargo.">Differential membrane perturbation caused by the cell penetrating peptide Tp10 depending on attached cargo.</a> FEBS Letters. 581 (13), 2389-2393 (2007).</li><li>van Rooijen, B. D., Claessens, M. M. A. E., Subramaniam, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+permeabilization+by+oligomeric+&#945;-Synuclein:+in+search+of+the+mechanism.">Membrane permeabilization by oligomeric &#945;-Synuclein: in search of the mechanism.</a> PloS One. 5 (12), 14292 (2010).</li><li>Hassane, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+cellular+trafficking+of+splice+redirecting+oligonucleotides+complexed+with+chemically+modified+cell-penetrating+peptides.">Insights into the cellular trafficking of splice redirecting oligonucleotides complexed with chemically modified cell-penetrating peptides.</a> Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 153 (2), 163-172 (2011).</li><li>Asciolla, J. J., Renault, T. T., Chipuk, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examining+BCL-2+family+function+with+large+unilamellar+vesicles.">Examining BCL-2 family function with large unilamellar vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e4291 (2012).</li><li>Grewer, C., Gameiro, A., Mager, T., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+characterization+of+membrane+transport+proteins.">Electrophysiological characterization of membrane transport proteins.</a> Annual Review of Biophysics. 42 (1), 95-120 (2013).</li></ol>

著者には利益相反はありません。

提示された蛍光漏れアッセイは、細胞透過性ペプチドによる膜不安定化に対処するための簡単で迅速な方法です。容易に行うと、それはまた、異なる膜相互作用ペプチドまたは他の膜相互作用分子間の間接的な比較を可能にする。プロトコルの重要なステップに関しては、このアッセイはベースライン(LUV単独)と最大蛍光放出(トリトン条件)の間の相対的な値を提供するので、通常、我々は、...

90年代に発見された後、細胞透過性ペプチド(CpP)は、原形質膜1,2を介した貨物の効率的な細胞送達を促進するために開発された。CpPは、通常、短いペプチド、一般的に8〜30個のアミノ酸、多種多様な起源を有する。彼らは最初に「直接転位」キャリアとして定義され、細胞膜を横断し、エネルギー要件も受容体関与も含み無い任意のエンドサイトー状態経路とは無関係に細胞に貨物を移すことができたことを意味する。しかし、さらなる調査は、これらの最初の観測は、主に、実験用アーティファクトおよび/またはメタノール3を用いた固定プロトコルによる蛍光過大評価から来たことを明らかにした。今日では、CPPの取り込みは、貨物の性質、CPPと貨物の間の使用リンク、研究されたセルラインなどの異なるパラメータに応じて、エンドサイトーシスとエネルギー独立転座4、5、6、7の両方で行われることが広く受け入れられています。
CpPは、CPPとその貨物8、9、10、11との間の化学的リンク(共有戦略)または静電/疎水性相互作用(非共有性戦略)を含む2つの戦略に従ってトランスフェクション剤として使用することができる。両方の戦略は、いくつかの貨物の細胞移動における効率を示しているが、CCPによる内在化のメカニズムの理解は依然として論争の下にあり、エンドサイトーシス経路または直接浸透間のバランスは12,13を測定することは依然として困難である。一連の実験ツールと戦略は、エンドサイトのプロセスの関与に明確に対処するために利用可能であるが、直接転位は、しかし、それは形質膜成分とのより離散的な相互作用を意味するので、より特徴付けが難しいようです。生体膜は通常、リン脂質から膜タンパク質まで、細胞の種類や環境(ストレス条件、細胞分裂など)によって異なる多くの成分で構成されています。この組成物の多様性、そして結果的に普遍的な細胞膜モデルの欠如は、単一の方法での研究を可能にしません。しかし、これらの限界を回避するために、ステップバイステップのアプローチは、人工膜または膜抽出物で開発された。小さな単層小胞から単層のアプローチまで、すべてのモデルは明らかに特定の質問14、15に答えるために関連していた。中でも、大きな単層小胞(RV)は、ペプチド/膜相互作用を内部化プロセスの重要なポイントとして研究するための適切な膜模倣モデルを構成しています。
この文脈において、以下のプロトコルは、陰イオン蛍光色素とリポソームに封入された対応するポリカチオンクエンチャーの両方のモニタリングを通じて、ペプチドおよびペプチド/膜相互作用がLUVの完全性に及ぼす影響の調査を記述する。このツールは、直接膜転座を行うことができるかどうかを理解するために、CPP/膜相互作用を研究するために使用されます。通常は異なる膜相互作用ペプチドを比較するために適用されますが、このLUV蛍光漏れアッセイは、CpPs-貨物コンジュゲート(共有戦略)とCPP:貨物複合体(非共有戦略)の両方を調査するためにも使用できます。
本プロトコルは、最近開発されたトリプトファン(W)とアルギニン(R)が豊富な媒性ペプチド(WRAP)16で最初に例示される。WRAPは、ペプチドベースのナノ粒子を形成し、いくつかの細胞株16において小さな干渉RNA(siRNA)を迅速かつ効率的に送達することができる。WRAPペプチド単独またはsiRNA搭載WRAPベースナノ粒子の蛍光漏れ特性をモニタリングし、細胞内在化のメカニズムを特徴付けた。我々は、内部化のメカニズムが主に直接転座7を含むことを示した。第2の例では、WRAPペプチドをタンパク質/タンパク質干渉ペプチドiCAL36(WRAP-iCAL36)17に共有結合し、膜を不安定化させる能力を、penetratin 18(Penetratin-iCAL36)と結合したiCAL36に対する蛍光漏れアッセイで比較した。
最後に、この方法の利点と限界は、技術的な観点から、生物学的関連性に関して議論される。

<table><tbody><tr><td>25 mL glass round-bottom flask</td><td>Pyrex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-aminonaphthalene-1, 3, 6-trisulfonic acid, disodium salt (ANTS)</td><td>Invitrogen</td><td>A350</td><td>Protect from light&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Chloroform&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>288306</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>DOPC (dioleoylphosphatidylcholine)</td><td>Avanti Polar</td><td>850375P</td><td>Protect from air</td></tr><tr><td>Extruder</td><td>Avanti Polar</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Fluorimeter</td><td>PTI Serlabo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 &amp;micro;L glass syringe</td><td>Hamilton</td><td>705N</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>LabAssay Phospholipid&amp;nbsp;</td><td>WAKO&amp;nbsp;</td><td>296-63801</td><td></td></tr><tr><td>liquid chromatography column</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Carlo Erba</td><td>414902</td><td></td></tr><tr><td>Nuclepore polycarbonate membrane (0.1 &amp;micro;m pore size, 25 mm diameter)</td><td>Whatman</td><td>800309</td><td></td></tr><tr><td>polystyrene cuvette, 10 x 10 x 45 mm</td><td>Grener Bio-One</td><td>614101</td><td></td></tr><tr><td>polystyrene semi-micro cuvette, DLS</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB55924</td><td></td></tr><tr><td>p-xylene-bispyridinium bromide (DPX)</td><td>Invitrogen</td><td>X1525</td><td>Protect from light&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>quartz fluorescence cuvette</td><td>Hellma</td><td>109.004F-QS</td><td></td></tr><tr><td>rotavapor system&amp;nbsp;</td><td>Heidolph</td><td>Z334898</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-50 resin</td><td>Amersham</td><td>17-0042-01</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide (NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chlorid (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator bath USC300T</td><td>VWR</td><td>142-6001</td><td></td></tr><tr><td>Sphingomyelin</td><td>Avanti Polar</td><td>860062P</td><td>Protect from air</td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>Eromedex</td><td>2000-B</td><td></td></tr><tr><td>Zetaziser NanoZS&amp;nbsp;</td><td>Malvern</td><td>ZEN3500</td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescent leakage assay to investigate membrane destabilization by cell-penetrating peptide

細胞貫通性ペプチド(CpP)は、細胞膜を横断し、細胞に貨物を移動することができるキャリアとして定義されます。この活性に必要な主な共通の特徴の1つは、CCPと血漿膜(脂質)の相互作用、特に膜自体の細胞外マトリックス(ヘパラン硫酸塩)の成分との相互作用から生じる。実際、直接転位またはエンドサイトーシス依存の内在化とは無関係に、脂質二重層は、細胞膜のレベルと細胞内トラフィック(内皮小胞)のレベルの両方で内在化プロセスに関与している。本稿では、蛍光漏れ測定法における大ユニラメラ小胞(LUV)製剤の様々なステップを説明する詳細なプロトコルを紹介し、CPP膜不安定化/相互作用の可能性を検出し、内部化メカニズムにおけるそれらの役割に対処する。細胞膜含量を反映した脂質組成物を有するRVは、蛍光色素とクエンチャーの両方を封入するために生成される。また、発光培地にペプチドを添加し、また、LUV上でのペプチド膜相互作用の誘導は、このように、蛍光の有意な増加を漏出を明らかにする用量依存的に誘導する可能性がある。例は、最近開発されたトリプトファン(W)-およびアルギニン(R)が豊富なアンフィパシーペプチド(WrAP)を備えており、様々な細胞株における迅速かつ効率的なsiRNA送達を示した。最後に、これらの相互作用の性質と脂質に対する親和性を理解し、膜転座および/または内膜脱出を改善するために議論される。

蛍光漏れ測定の原理を 図1に示す。詳細には、蛍光色素とクエンチャー(蛍光シグナルなし)をカプセル化した大きなユニラメラ小胞(RV)を、目的の生体分子で処理します。脂質膜とのペプチドの相互作用により、膜透過性、再編成、あるいは破裂を意味する可能性があるため、蛍光色素およびクエンチャーは、RVから放出される。バッファー内のそ...

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Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide

蛍光漏れアッセイは、ペプチド/膜相互作用の調査を可能にする簡単な方法であり、いくつかの生物学的プロセスへの関与、特に細胞内転位プロセス中に細胞透過性ペプチドが二重層のリン脂質を乱す能力を理解する。

細胞透過性ペプチドによる膜不安定化を調べる蛍光漏れアッセイ

Cell-penetrating peptides (CPPs) are defined as carriers that are able to cross the plasma membrane and to transfer a cargo into cells. One of the main ...

fluorescent-leakage-assay-to-investigate-membrane-destabilization

Research

JoVE Journal

Biochemistry

6.2K ビュー.  INSERM U1046 - CNRS UMR 9214 - University of Montpellier. 蛍光漏れアッセイは、ペプチド/膜相互作用の調査を可能にする簡単な方法であり、いくつかの生物学的プロセスへの関与、特に細胞内転位プロセス中に細胞透過性ペプチドが二重層のリン脂質を乱す能力を理解する。

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Construction of Cyclic Cell-Penetrating Peptides for Enhanced Penetration of Biological Barriers

Cancer has been a grand challenge in global health. However, the complex tumor microenvironment generally limits the access of therapeutics to deeper tumor cells, leading to tumor recurrence. To conquer the limited penetration of biological barriers, cell-penetrating peptides (CPPs) have been discovered with excellent membrane translocation ability and have emerged as useful molecular transporters for delivering various cargoes into cells. However, conventional linear CPPs generally show compromised proteolytic stability, which limits their permeability across biological barriers. Thus, the development of novel molecular transporters that can penetrate biological barriers and exhibit enhanced proteolytic stability is highly desired to promote drug delivery efficiency in biomedical applications. We have previously synthesized a panel of short cyclic CPPs with aromatic crosslinks, which exhibited superior permeability in cancer cells and tissues compared to their linear counterparts. Here, a concise protocol is described for the synthesis of the fluorescently labeled cyclic polyarginine R8 peptide and its linear counterpart, as well as key steps for investigating their cell permeability.

This protocol describes the synthesis of cyclic cell-penetrating peptides with aromatic cross-links and the evaluation of their permeability across biological barriers.

生物学的障壁の浸透促進のための環状細胞透過性ペプチドの構築

Cancer has been a grand challenge in global health. However, the complex tumor microenvironment generally limits the access of therapeutics to deeper ...

化学

Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope

Numerous pathophysiological insults can cause damage to cell membranes and, when coupled with innate defects in cell membrane repair or integrity, can result in disease. Understanding the underlying molecular mechanisms surrounding cell membrane repair is, therefore, an important objective to the development of novel therapeutic strategies for diseases associated with dysfunctional cell membrane dynamics. Many in vitro and in vivo studies aimed at understanding cell membrane resealing in various disease contexts utilize two-photon laser ablation as a standard for determining functional outcomes following experimental treatments. In this assay, cell membranes are subjected to wounding with a two-photon laser, which causes the cell membrane to rupture and fluorescent dye to infiltrate the cell. The intensity of fluorescence within the cell can then be monitored to quantify the cell's ability to reseal itself. There are several alternative methods for assessing cell membrane response to injury, as well as great variation in the two-photon laser wounding approach itself, therefore, a single, unified model of cell wounding would beneficially serve to decrease the variation between these methodologies. In this article, we outline a simple two-photon laser wounding protocol for assessing cell membrane repair in vitro in both healthy and dysferlinopathy patient fibroblast cells transfected with or without a full-length dysferlin plasmid.

Cell membrane wounding via two-photon laser is a widely used method for assessing membrane resealing ability and can be applied to multiple cell types. Here, we describe a protocol for in vitro live-imaging of membrane resealing in dysferlinopathy patient cells following two-photon laser ablation.

2 光子レーザー顕微鏡を用いた細胞膜修復法

Numerous pathophysiological insults can cause damage to cell membranes and, when coupled with innate defects in cell membrane repair or integrity, can ...

免疫・感染学

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1. Many of these are referred to as cell-penetrating peptides, which are frequently noted for their potential as drug delivery vectors1-3. Moreover, there is increasing interest in antimicrobial peptides that operate via non-membrane lytic mechanisms4,5, particularly those that cross bacterial membranes without causing cell lysis and kill cells by interfering with intracellular processes6,7. In fact, authors have increasingly pointed out the relationship between cell-penetrating and antimicrobial peptides1,8. A firm understanding of the process of membrane translocation and the relationship between peptide structure and its ability to translocate requires effective, reproducible assays for translocation. Several groups have proposed methods to measure translocation into large unilamellar lipid vesicles (LUVs)9-13. LUVs serve as useful models for bacterial and eukaryotic cell membranes and are frequently used in peptide fluorescent studies14,15. Here, we describe our application of the method first developed by Matsuzaki and co-workers to consider antimicrobial peptides, such as magainin and buforin II16,17. In addition to providing our protocol for this method, we also present a straightforward approach to data analysis that quantifies translocation ability using this assay. The advantages of this translocation assay compared to others are that it has the potential to provide information about the rate of membrane translocation and does not require the addition of a fluorescent label, which can alter peptide properties18, to tryptophan-containing peptides. Briefly, translocation ability into lipid vesicles is measured as a function of the Foster Resonance Energy Transfer (FRET) between native tryptophan residues and dansyl phosphatidylethanolamine when proteins are associated with the external LUV membrane (Figure 1). Cell-penetrating peptides are cleaved as they encounter uninhibited trypsin encapsulated with the LUVs, leading to disassociation from the LUV membrane and a drop in FRET signal. The drop in FRET signal observed for a translocating peptide is significantly greater than that observed for the same peptide when the LUVs contain both trypsin and trypsin inhibitor, or when a peptide that does not spontaneously cross lipid membranes is exposed to trypsin-containing LUVs. This change in fluorescence provides a direct quantification of peptide translocation over time.

This protocol details a method for the quantitative measure of peptide translocation into large unilamellar lipid vesicles. This method also provides information about the rate of membrane translocation and can be used to identify peptides that efficiently and spontaneously cross lipid bilayers.

大型単層小胞へのペプチドの転座の測定

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

生物学

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

膜タンパク質の緑色蛍光タンパク質ベースの発現スクリーニングで<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

蛍光プロテアーゼ保護を使用して膜タンパク質のトポロジの決定（FPP）

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.

This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.

細胞におけるミスフォールドタンパク質の分解のためのアッセイ

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded ...

Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular organelles and those localized on the plasma membrane. Traditional fluorescence-based measurements lack the capability to distinguish membrane proteins residing in different organelles. Cutting edge methodologies transcend traditional methods by coupling pH-sensitive fluorophores with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). TIRF illumination excites the sample up to approximately 150 nm from the glass-sample interface, thus decreasing background, increasing the signal to noise ratio, and enhancing resolution. The excitation volume in TIRFM encompasses the plasma membrane and nearby organelles such as the peripheral ER. Superecliptic pHluorin (SEP) is a pH sensitive version of GFP. Genetically encoding SEP into the extracellular domain of a membrane protein of interest positions the fluorophore on the luminal side of the ER and in the extracellular region of the cell. SEP is fluorescent when the pH is greater than 6, but remains in an off state at lower pH values. Therefore, receptors tagged with SEP fluoresce when residing in the endoplasmic reticulum (ER) or upon insertion in the plasma membrane (PM) but not when confined to a trafficking vesicle or other organelles such as the Golgi. The extracellular pH can be adjusted to dictate the fluorescence of receptors on the plasma membrane. The difference in fluorescence between TIRF images at neutral and acidic extracellular pH for the same cell corresponds to a relative number of receptors on the plasma membrane. This allows a simultaneous measurement of intracellular and plasma membrane resident receptors. Single vesicle insertion events can also be measured when the extracellular pH is neutral, corresponding to a low pH trafficking vesicle fusing with the plasma membrane and transitioning into a fluorescent state. This versatile technique can be exploited to study localization, expression, and trafficking of membrane proteins.

Labeling the extracellular domain of a membrane protein with a pH sensitive fluorophore, superecliptic pHluorin (SEP), allows subcellular localization, expression, and trafficking to be determined. Imaging SEP-labeled proteins with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) enables the quantification of protein levels in the peripheral ER and plasma membrane.

細胞内局在や人身売買を監視するpHluorinタグ付き受容体を利用します

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular ...

Fluorescence Microplate-Based Cycloheximide Chase Assay: A Technique to Monitor the Degradation Kinetics of Fluorescent Nuclear Misfolded Proteins

Source: Guo, L. et. al., <a href="https://app.jove.com/v/54266">Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video describes an in vitro fluorescence-based microplate assay to study the degradation kinetics of a fluorescently-labeled misfolded luciferase mutant protein expressed in the nuclei of transfected mammalian cells. The assay involves the treatment of cells expressing the fluorescent mutant protein with a translation inhibitor and a proteasome inhibitor to assess the proteasome-mediated degradation of the misfolded protein.

蛍光マイクロプレートベースのシクロヘキシミドChaseアッセイ:蛍光核ミスフォールドタンパク質の分解速度を監視する技術

Source: Guo, L. et. al., Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells. J. Vis. Exp. (2016)
This video describes an in vitro ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

生物学的手法

アッセイ技術

生化学的アッセイ

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen the Proteolytic Activity of Proteases

Source: Jaimes, J. A., et al. <a href="https://app.jove.com/v/58892">A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates an assay to screen for the proteolytic activity of proteases using fluorogenic peptides. The protease recognizes its cleavage site on the peptide, cleaving it and separating the quencher from the fluorophore, enabling its fluorescence emission. The fluorescence signal is detected and analyzed to check for the cleavage efficiency of different peptide variants.

プロテアーゼのタンパク質分解活性をスクリーニングするための蛍光性ペプチド切断アッセイ

1. Designing and Preparing the Peptides

	Acquire the sequence of the fusion protein of interest from a public database such as NCBI ...

免疫学

免疫診断

特殊なアッセイ

Fluorescence Leakage Assay to Study Cell-Penetrating Peptide Interaction with Membrane

Source: Konate, K. et al. <a href="https://app.jove.com/v/62028">Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide.</a> J. Vis. Exp. (2020)
This video discusses the fluorescence leakage assay to study the interactions of cell-penetrating peptides with cell membranes using cell membrane mimics &#8212; large unilamellar vesicles, or LUVs, encapsulated with a fluorescent dye and a quencher.

細胞透過性ペプチドとメンブレンとの相互作用を研究するための蛍光リークアッセイ

Source: Konate, K. et al. Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide. J. Vis. Exp. (2020)
This video ...