初代培養における杯細胞の機能を研究することで、眼表面の健康状態における性差の背後にあるメカニズムに関する貴重な洞察を得ることができます。すでに確立されている結膜杯細胞の初代培養法を改良し、ホルモンやエストロゲン様物質を除去することで、より精密な性ホルモン量のコントロールを可能にしました。この変更により、調査結果の精度と信頼性が向上します。
細胞内カルシウム測定は、さまざまな刺激下での杯細胞の機能と、各刺激によって引き起こされる細胞内シグナル伝達経路を調べる方法です。この技術は、眼アレルギー、ドライアイ疾患、結膜炎などの眼表面疾患の医薬品開発に拡張できます。この技術により、特定のホルモンレベル下での杯細胞に対するさまざまな分子の影響のスクリーニングが容易になります。
この技術に不慣れな人は、結合組織から結膜組織を分離するのに苦労することがよくあります。私たちのアドバイスは、組織の質感と材料特性に細心の注意を払うことです。結膜は弾力性があり半透明であるべきですが、結合組織は通常、色が薄く、綿繊維のようです。
まず、滅菌メスを使用して、ヒトの結膜組織を1ミリメートルの立方体に細かく刻みます。6ウェルプレートで、1 mmメートルの完全RPMI培地を含む各ウェルに4個を播種します。必ずピースをプレートに固定してください。
組織片を摂氏37度、二酸化炭素5%、空気95%でインキュベートします。培地は2日おきにリフレッシュしてください。播種から72時間後、組織プラグを取り外し、杯細胞が70〜80%のコンフルエントに達するまでインキュベーションを続けます。
次に、細胞をPBSで洗い流し、0.05%トリプシンEDTAを添加して、プレートの底から細胞を剥離します。顕微鏡で細胞の剥離を観察します。そして、細胞が剥離したら、完全なRPMI培地を添加してトリプシンを不活性化します。
細胞懸濁液を150 Gで5分間遠心分離し、ペレットをフェノールレッドフリーRPMI培地に再懸濁します。次に、細胞内カルシウム濃度測定のために、細胞懸濁液をガラス底培養皿に再播種します。Fura-2 AMローディングの場合は、0.5%HEPES、0.5%BSA、および0.5マイクロモルのFura-2 AM、8マイクロモルのプルロン酸F127、および250マイクロモルのスルフィンピラゾンを含むKrebs-Ringer重炭酸緩衝液を、杯細胞を含むガラス底の皿に添加します。
細胞を摂氏37度で1時間インキュベートし、光から保護します。インキュベーション後、250マイクロモルのスルフィンピラゾンを含むKrebs-Ringer重炭酸緩衝液で細胞を洗浄します。細胞内カルシウム濃度測定は、Fura-2を充填した細胞の入ったディッシュを顕微鏡下に置く。
次に、倍率を200倍にします。20 から 50 個のセルを含む代表的なフィールドを見つけます。フリーハンド機能を使用して、各セルの周囲に輪郭を描き、バックグラウンド蛍光と区別し、ソフトウェアが測定からバックグラウンド蛍光を自動的に差し引くのを待ちます。
[実験の開始]ボタンをクリックし、8〜15秒待って、細胞内のベースラインカルシウムレベルを決定します。次に、コリン作動性アゴニストのカルバコールを慎重に加え、少なくとも120秒間、またはカルシウムレベルがベースラインに戻るまで測定を続けます。.ピーク細胞内カルシウム濃度の変化を使用して、測定の最初の8秒から15秒までの各細胞の平均基礎カルシウムレベルを計算します。
平均基礎カルシウム濃度が500ナノモル以上の細胞をデータセットから削除します。次に、各細胞の最大細胞内カルシウム濃度を計算します。次に、同じ細胞で測定された最大細胞内濃度から基礎カルシウムレベル値を差し引きます。
最後に、皿内のすべての細胞のピーク細胞内カルシウム濃度の変化を平均します。ヒト結膜杯細胞の純度は、杯細胞マーカーであるサイトケラチンおよびヘリックスポマチアレクチン1に特異的な抗体を用いて、免疫蛍光染色によって確認されました。Fura-2 AMアッセイの結果では、フェノールレッドフリーRPMIと1%BSAでインキュベートした細胞と完全RPMI培地の間に有意差は見られませんでした。
しかし、カルバコールに対する細胞内カルシウム反応の有意な増加は、進行したRPMI培地群と完全なRPMI培地群を比較すると観察されました。最も重要なことは、十分な細胞密度の初代ヒト杯細胞培養物を得ることです。増殖中は、効果的な伸長のために組織片が培養プレートに付着していることを確認してください。
研究者らは、さまざまな阻害剤を塗布したり、受容体を標的にしたり、刺激前に細胞にシグナル伝達分子を投与したりすることで、特定の経路の関与を調べることができました。ムチン分泌やマイトジェン活性化プロテインキナーゼの不活性化など、杯細胞機能を示す他のパラメータも評価できます。相補的な測定により、さまざまな刺激に対する杯細胞の反応を包括的に理解することができます。
