DIY極検索装置は、プロジェクトがん研究プログラムは、科学のバージニア州アカデミーのメアリー·ルイーズ·アンドリュース·アワード主催の &quot;バイオインフォマティクスと分子のアプローチを用いて真核細胞のモデル化細菌タンパク質のプレニル化&quot;、 &quot;プラズマ中のRNA編集の生理的意義の過程でテストされていたトーマスF. JeffressとケイトミラーJeffressメモリアルトラストと国家契約16.740.11.0364（科学と教育省、ロシア）が主催する樹状細胞 &quot;。我々は、RNAの完全性実験の支援についてはベスオムに感謝します。

1。 Cryoboxesの検索のためのCryotolerantデバイスの組立<ol><li>ペンチを使用して、 図1Bに示すように、強力なネクタイLは形にする（ 図1A）3面の強いタイの一面をまっすぐ注：強力なネクタイの寸法は、デュワーの首の直径に応じて選択することができます。 </li><li> 図3（AB）に示すようにCryoscoop基盤を形成するために、クラウンのボルトナット、ワッシャーとネジを使用して強力なネクタイTストラップ（ 図2）このような2つの強い結びつきを確保する注：2つの強い絆の検索を可能にするために使用されている5½インチ×5½インチcryoboxes。 </li><li>溝付きプレート（ 図4）を使用して 、スロット板の一方の端のスロットに強力なネクタイTストラップのスロットを合わせ、ヒルマンナットとボルト（ 図5）の助けを借りて2つを確保する注：場合スロット板と強力な提携のは共存しません私は、事前にドリル穴を使用すれば、超硬ドリルビットを使用して、ドリル穴を持っている必要があります。 </li><li> 図6に示すように、ペンチの助けを借りて、スロット板のもう一方の端を曲げます。 （この手順は省略可能です）。 </li><li>液体窒素中で図6に示すように、ときに優れたデバイスを把握するために泡でハンドルをラップします。 （オプション） 注意：オートクレーブの前に泡を削除します。 </li></ol> 2。 Cryovialsの検索のためのCryotolerantデバイスの組立 Cryotolerant DIYの検索装置は、cryovialsの取得するために適合させることができます。これは液体窒素（ 図7）からバイアルをすくうための改変に示すようにステンレス製のストレーナーとフラットベースを置換が含まれます。 <ol><li>溝付きプレートに強力なネクタイTストラップを取り付けるネジを外し、クラウンナットとボルト。 </li><li>溝付きプレートにステンレス製のストレーナーを取り付ける前に、そっとの首を曲げる。鍋（ 図8）に似せて角度で向きをベースにペンチの助けを借りて、ストレーナー注：ストレーナーはリップが付属している場合は、唇を曲げてペンチを使用して、これは容易にデバイスで操縦しています。 </li><li>溝付きプレートの穴に沿ってストレーナーのハンドルの穴を合わせ、 図8に示すように、ヒルマンナットとボルトの助けを借りて、ストレーナを固定注：ストレーナーはプレドリル穴に付属していない場合は、次のものが必要となります超硬ドリルビットであけられた穴を持つように手配します。 </li></ol> 3。デュワーから取得CryoboxesとCryovials <ol><li>開始するには、極低温の手袋をつけて、操縦のスペースを確保するためにデュワーから1または2フリーザーラックを削除します。 </li><li>優しく強いネクタイTストラップ·ベース（ 図5）を装備直立Cryotolerant DIY取得デバイスとデュワーの底に沿ってこすり、ボックスfalleを収集するデュワータンクの底にn 注：液体窒素の沸騰は、すぐに暖かい物体と接触すると、窒素ガス（ライデンフロスト効果）を絶縁内のオブジェクトを包む。サンプルの取得する前にデバイスを冷却するために、ゆっくりとデュワーにデバイスを浸すと、液体窒素は、上記の手順に進む前に十分にデバイスを冷却することができます。 </li><li>タンクのうちフリーザーボックスをすくうためにデュワーの壁に沿って直立デバイスを引き出します。 </li><li>デュワーの底から取得したボックスをつかむ。 </li><li> cryovialsを取得するために、穏やかにストレーナー（ 図9）を装備しcryoscoopとデュワーの底をこすり。 </li><li> cryobox検索と同様に、直立デバイスを引き出し、ストレーナーで収集されたバイアルをつかむ。 </li></ol> 4。代表的な結果遺伝子発現研究における主要な課題は、RNAの品質は保管条件に依存していることです。両方の凍結組織サンプルのRNAと4を抽出した。 図10は、トータルRNAの完全性のサンプル処理の効果を示しています。同じ組織源（ヒト脂肪）からのトータルRNAは、異なるサンプル処理に供した。実験前に、無傷のトータルRNA preparateは約2倍の18S rRNAのバンド（ 図10、レーン1）のような激しいとして28S rRNAのバンドとの明確な28Sと18S rRNAのバンドを示しています。 18Sの強度比が2:1 5から出発する：この2:1の比率（28S：18S）は、部分的に分解したRNAは、塗抹標本、またはその28Sのように表示されますが、RNAは無傷であることを示しています。 3から4レーンは大幅に低下してRNAサンプルを示しています。これらのRNAサンプルは、このように定期的に堕落したバイアルの取得の必要性のためにデカントし、ボックス（ 図10、3-4レーンと長期的なストレージをモデル化し、デュワー（方法）から、短期取得の繰り返される部分defreezingに供した。）しかし、サンプルはデュワーサービスに格納されているDIYのデバイス（方法B）と、このように、部分的なdefreezingを使用して、インタクトなRNA（ 図10、レーン2）を含んでいます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig1.jpg" /> 図1。 A）基地は、2つの3面の強力なネクタイに示した寸法で構成されています。それぞれ強力なネクタイは、一つの大きなプレドリル穴（実線の矢印）と、各面に複数の小さな穴（小さい矢印）が含まれています。これは、ナットとボルトで固定できるようにするオプションを提供しています。また、小さな穴は、サンプル取得時に液体窒素の迅速な排水を可能にします。B）の強いタイのそれぞれの片側がL字型の強力なネクタイにするペンチの助けを借りてまっすぐにされています。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig2.jpg" /> 図2：厳密なネクタイTストラップが一緒の強い結びつきを確保するために使用されます。強力なネクタイ、T-ストラップのように一つの大きなプレドリル穴（実線の矢印）と二つの小さな穴（Smalのを持っている各コーナーにL矢印）。ナットとボルトを使用して、ペニスバンド - これは、Tの長さに沿っての強い結びつきを確保することができます。また、溝板にT-ストラップを固定することができます。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig3.jpg" /> 図3。 a）各強いネクタイ）は、B。冠ボルト、ナット、ボルト、ワッシャを使用して、その長さに沿って、T-ストラップの一方の隅に固定されている二つの強い絆は、5½インチ×5½を取得するために、お互いに隣接して固定されているcryoboxesインチ。このようなインチX 2インチ2のような小さいcryoboxesは、単一の強力なネクタイは、T-ストラップなしでスロット板に直接固定することができます。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig4.jpg" /> 図4は、平板は、ハンドルとして使用されているスロット。溝付きプレートの長さはデュワーの深さに依存します。このケースでは、スロット板の4フィートが使用されています。スロット板の厚さが重要なのです。デュワーを満たした液体窒素からサンプルを取得中に細い溝プレート（&lt;14ゲージ）は、デバイスが薄っぺらするインス。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig5.jpg" /> 図5。の強い絆とTストラップで構成されるフラットベースは、その後スロット板の一端に固定されています。 Tストラップの残りの角に大きな穴が平板上のスロットに合わせ、六角ボルトとナットを使用して固定されている。このデバイスは、現在デュワーからcryoboxesを取得するために使用することができます。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig6.jpg" /> 図6。スロット平板の一端は、ペンチを使って曲げて、この場合に示すように、特に深いデュアーのためのより良いグリップを提供するために泡で覆われています。 <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig7.jpg" /> 図7：ワイヤーメッシュ、ステンレス鋼製ハンドル付きストレーナーデュワーからcryovialsを取得するために使用されています。ハンドルはスロットで提供されていない場合、超硬ビットドリルは穴をあけるため必要となります。 <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig8.jpg" /> 図8。cryovialsの検索を容易にするためには、ストレーナーは、鍋の形ストレーナを得るためにペンチを使用して、首に沿って折り曲げられている。ストレーナーは、この場合のようにリップが付属している場合は、ペンチは、それを曲げるために使用できます。これは、ストレーナはデュワー内に巻き込まれないことが保証されます。 <img alt="図9" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig9.jpg" /> 図9。ストレーナーは、六角ナットとボルトを使用して1つの端に溝付き平板に固定されている。 <img alt="図10" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig10.jpg" /> 図10。のトータルRNAサンプルの完全性は、異なるサンプル処理条件に供した。RNAの品質はcを処理するサンプルでどのように影響されるか調べるためにonditionsは、同じソースからのRNAサンプルのセットは、ハンドリングの2つの方法に供した。メソッドのため、DIYのデバイスを使用して、サンプル取得時にかけデュワー、部分的なdefreezingでRNAのストレージで構成されていた。方法Bは、このように、定期的に落ちたサンプルを取得するためにデカントで長期保管をモデリングし、デュワーからの短期取得の繰り返される部分defreezingにさらさデュワー中のRNAのストレージで構成されていた。トータルRNAの整合性は、その後、ゲル電気泳動によって分析した。 Lane1：デュワー内の記憶の前にサンプル、レーン2：デュワーからのサンプルは、メソッドによって取得を受け、レーン3、4：方法Bによって検索の対象とデュワーからのサンプル、M：100 bpのラダー。

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利害の衝突が宣言されません。

デュワータンクの底からcryoboxesとcryovialsを取得する最も一般的な方法の1つは、予備容器に液体窒素をデカントし、デカントし、液体窒素中でフラスコまたはフローティングに残っているサンプルを引き出すことです。しかし、これは、液体窒素蒸気に長時間さらされる2による低温火傷や窒息を引き起こす可能性があり危険な習慣です。落ちcryovialsの取得他の一般的な方法は、クライ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>ヒルマン·グループメッキスロットフラット1-3/8 X 4フィート、14ゲージ</td><td>ローカルハードウェアのショップ</td><td> N / A </td><td> 1ユニットが必要</td></tr><tr><td>クラウンボルトステンレス＃6 - オーバルヘッドフィリップスドライブの機械ネジ32インチ×3/8 </td><td>ローカルハードウェアのショップ</td><td>モデル＃42281 </td><td>必要な4単位</td></tr><tr><td>クラウンボルト亜鉛メッキスチールフェンダーワッシャーインチ×1-1/2インチ3月8日</td><td>ローカルハードウェアのショップ</td><td>モデル＃20122 </td><td>必要な4単位</td></tr><tr><td>クラウンボルト亜鉛めっき＃8-32ネジのナット</td><td>ローカルハードウェアのショップ</td><td>モデル＃18512 </td><td>必要な4単位</td></tr><tr><td>シンプソンストロング - タイBC40Zハーフベース4インチIn.x4 </td><td>ローカルハードウェアショップ</td><td>モデル＃BC40Z </td><td>必要な2台</td></tr><tr><td> Tストラップインチ×6インチシンプソンストロング - タイ6 </td><td>ローカルハードウェアのショップ</td><td>モデル＃66T </td><td> 1ユニットが必要</td></tr><tr><td>オナイダ6 &quot;メッシュストレーナー</td><td>地元の食料品店</td><td>モデル＃7859W </td><td> 1ユニットが必要</td></tr><tr><td>ヒルマン·グループでは、六角ナット3/8-16の亜鉛メッキ</td><td>ローカルハードウェアのショップ</td><td>モデル番号：810509 </td><td>必要な6単位</td></tr><tr><td>ヒルマン·グループでは、六角ボルト3/8- 16亜鉛メッキ</td><td>ローカルハードウェアのショップ</td><td></td><td>必要な4単位</td></tr><tr><td>絶縁用泡</td><td>ローカルハードウェアのショップ</td><td></td><td> 1ユニットが必要</td></tr><tr><td>ねじ回し</td><td>ローカルハードウェアのショップ</td><td></td><td> 1ユニットが必要</td></tr><tr><td>ペンチ</td><td>ローカルハードウェアのショップ</td><td></td><td> 1ユニットが必要</td></tr></tbody></table>

do-it-yourself device for recovery of cryopreserved samples accidentally dropped into cryogenic storage tanks

液体窒素の圧力下に置かれ、無色、無臭、非常に冷たい（-196℃）で液体である。それは一般的に、血液、細胞や組織の1,2のような生物学的物質の長期保存のための極低温流体として使用されます。液体窒素の低温の性質は、サンプルの保存のための理想的な一方、接触のライブの組織の急速凍結を引き起こす可能性があります- &#39;凍傷&#39; 2として知られている、密接にストレージ、デュアーからのサンプルの取得に関係者に重度の凍傷につながる可能性があります。さらに、液体窒素が蒸発としては、特に限られたスペース2に、空気中の酸素濃度を低減し、窒息を引き起こす可能性があります。 研究室で、生物学的サンプルは、多くの場合、デュワータンク1内のステンレス製ラックに積み重ねcryovialsまたはcryoboxesに格納されています。これらのストレージラックは、ラックからも抜けボックスを防止するために、長いシャフトととの底面に用意されていますルーチン処理時のデュアー。すべて余りに頻繁に、しかし、貴重なサンプルのボックスまたはバイアルに抜け出し、液体窒素を充填タンクの底に沈む。そのような場合には、サンプルがうんざりするほどのスペア容器または廃棄するに液体窒素を転送した後に取得することができます。箱やバイアルは、比較的安全に空にデュワーから回収することができる。しかし、液体窒素とその膨張率の低温性質が沈没したサンプルの取得危険になります。それは一般的にサンプルの検索が一人で行っ決してすることが安全局によって推奨されています。別の方法としては、バイアル3を取り出して、市販のクールグラバーやトングを使用することです。しかし、暗い液体充填デュアー内の限られた可視性は、それらの使用に大きな制限が課される。 本稿では、安全な両方の極低温流体を含むデュワーからのサンプルの取得を行うCryotolerant DIYの取得、デバイスの構造を記述する簡単に購入する。

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Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

ここでは、液体窒素を充填したデュワータンクからサンプル取得のための低コスト、耐久性のあるcryotolerantデバイスを提示します。装置の構成とモジュール設計のしやすさ、安全かつ容易に極低温タンクからのサンプル取得のプロセスになります。

凍結保存サンプルの回復のための日曜大工のデバイスが誤って低温貯蔵タンクに落とし

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

do-it-yourself-device-for-recovery-cryopreserved-samples-accidentally

Research

JoVE Journal

Biology

25.0K ビュー.  George Mason University. ここでは、液体窒素を充填したデュワータンクからサンプル取得のための低コスト、耐久性のあるcryotolerantデバイスを提示します。装置の構成とモジュール設計のしやすさ、安全かつ容易に極低温タンクからのサンプル取得のプロセスになります。

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Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for culturing neurons. Previously, a silicon wafer was patterned with the design for the neuron microfluidic device using SU-8 and photolithography to create a master mold, or what we simply refer to as a "master". Next, we pour the silicon polymer PDMS on top of the master which is then cured by heating the PDMS to 80&deg;C for 1 hour. The PDMS forms a negative mold of the device. The PDMS is then carefully cut and lifted away from the master. Holes are punched where the reservoirs will be and the excess PDMS trimmed away from the device. Nitrogen is used to blow away any excess debris from the device. At this point the devices are now ready for use and can either bonded to corning No. 1 cover glass with a plasma sterilizer/cleaner or can be reversibly bound to the cover glass by simply placing the device on top of the cover glass. The reversible bonding of the device to glass is covered in a separate video and requires first that the device be sterilized either with 70% ethanol or by autoclaving. Plasma treating sterilizes the devices so no further treatment is necessary. It is, however, important, when plasma-treating the devices, to add liquid to the devices within 10 minutes of the plasma treatment while the surfaces are still hydrophilic. Waiting longer than 10 minutes to add liquid to the device makes it difficult for the liquid to enter the device. The neuron devices are typically plasma-bound to cover glass and 0.5 mg/ml poly-L-lysine (PLL) in pH 8.5 borate buffer is immediately added to the device. After a minimum of 3 hours incubating with PLL, the devices are washed with dH2O water a minimum of 3 times with at least 15 minutes between each wash. Next, the water is removed and fresh media is added to the device. At this point the device is ready for use. It is important to remember at this point to never remove all the media from the device. Always leave media in the main channel.

In this video we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to farbricate a microfluidic device for culturing neurons.

ニューロン相馬と軸索のコンパートメントのためのマイクロ流体デバイスの作製

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for ...

生物学

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an enabling experimental tool, because it can precisely manipulate fluid flows, enable high-throughput experiments, and generate stable soluble concentration gradients.  Compared to conventional gradient generators, poly(dimethylsiloxane) (PDMS)-based  microfluidic devices can generate stable concentration gradients of growth factors with well-defined profiles.  Here, we developed simple gradient-generating microfluidic devices with three separate inlets.  Three microchannels combined into one microchannel to generate concentration gradients.  The stability and shape of growth factor gradients were confirmed by fluorescein isothyiocyanate (FITC)-dextran with a molecular weight similar to epidermal growth factor (EGF).  Using this microfluidic device, we demonstrated that fibroblasts exposed to concentration gradients of EGF migrated toward higher concentrations.  The directional orientation of cell migration and motility of migrating cells were quantitatively assessed by cell tracking analysis.  Thus, this gradient-generating microfluidic device might be useful for studying and analyzing the behavior of migrating cells.

We describe a protocol for the microfabrication of the gradient-generating microfluidic device that can generate spatial and temporal gradients in well-defined microenvironment. In this approach, the gradient-generating microfluidic device can be used to study directed cell migration, embryogenesis, wound healing, and cancer metastasis.

細胞生物学の勾配を生むマイクロ流体デバイス

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an ...

Direct Tracheal Instillation of Solutes into Mouse Lung

Intratracheal instillations deliver solutes directly into the lungs. This procedure targets the delivery of the instillate into the distal regions of the lung, and is therefore often incorporated in studies aimed at studying alveoli. We provide a detailed survival protocol for performing intratracheal instillations in mice. Using this approach, one can target delivery of test solutes or solids (such as lung therapeutics, surfactants, viruses, and small oligonucleotides) into the distal lung. Tracheal instillations may be the preferred methodology, over inhalation protocols that may primarily target the upper respiratory tract and possibly expose the investigator to potentially hazardous substances. Additionally, in using the tracheal instillation protocol, animals can fully recover from the non-invasive procedure. This allows for making subsequent physiological measurements on test animals, or reinstallation using the same animal. The amount of instillate introduced into the lung must be carefully determined and osmotically balanced to ensure animal recovery. Typically, 30-75 &mu;L instillate volume can be introduced into mouse lung.

Intratracheal instillations deliver solutes directly into the lungs. This procedure targets the delivery of the instillate into the distal regions of the lung, and is therefore often incorporated in studies aimed at studying alveoli. We provide a detailed survival protocol for performing intratracheal instillations in mice.

マウス肺への溶質の直接気管点眼

Intratracheal instillations deliver solutes directly into the lungs.  This procedure targets the delivery of the instillate into the distal regions of the ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

直接アダルトゼブラフィッシュの腎臓への細胞の移植

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy techniques. However, as the image is acquired in a very different way than normal, by building up an image molecule-by-molecule, there are some significant challenges for users in trying to optimize their image acquisition. In order to aid this process and gain more insight into how STORM works we present the preparation of 3 test samples and the methodology of acquiring and processing STORM super-resolution images with typical resolutions of between 30-50 nm. By combining the test samples with the use of the freely available rainSTORM processing software it is possible to obtain a great deal of information about image quality and resolution. Using these metrics it is then possible to optimize the imaging procedure from the optics, to sample preparation, dye choice, buffer conditions, and image acquisition settings. We also show examples of some common problems that result in poor image quality, such as lateral drift, where the sample moves during image acquisition and density related problems resulting in the 'mislocalization' phenomenon.

We describe the preparation of three test samples and how they can be used to optimize and assess the performance of STORM microscopes. Using these examples we show how to acquire raw data and then process it to acquire super-resolution images in cells of approximately 30-50 nm resolution.

最適STORM超解像顕微鏡のためのテストサンプル

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

ハイスループットのアプリケーションのための大人のゼブラフィッシュハーツの回復

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, microbiome modification is designed to concentrate genomic DNA of a target foodborne pathogen contaminant to facilitate the detection and subtyping of the pathogen in a single workflow. Here, we explain and demonstrate the sample preparation steps for the quasi-metagenomics analysis of Salmonella enterica from representative food and environmental samples including alfalfa sprouts, ground black pepper, ground beef, chicken breast and environmental swabs. Samples are first subjected to the culture enrichment of Salmonella for a shortened and adjustable duration (4&#8211;24 h). Salmonella cells are then selectively captured from the enrichment culture by immunomagnetic separation (IMS). Finally, multiple displacement amplification (MDA) is performed to amplify DNA from IMS-captured cells. The DNA output of this protocol can be sequenced by high throughput sequencing platforms. An optional quantitative PCR analysis can be performed to replace sequencing for Salmonella detection or assess the concentration of Salmonella DNA before sequencing.

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Here, we present a protocol to prepare DNA samples from food and environmental microbiomes for concerted detection and subtyping of Salmonella through quasimetagenomic sequencing. The combined use of culture enrichment, immunomagnetic separation (IMS), and multiple displacement amplification (MDA) allows effective concentration of Salmonella genomic DNA from food and environmental samples.&#160;

食品および環境試料からのサルモネラの準メタゲノム解析

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, ...

Reproductive Techniques for Ovarian Monitoring and Control in Amphibians

Ovarian control and monitoring in amphibians require a multi-faceted approach. There are several applications that can successfully induce reproductive behaviors and the acquisition of gametes and embryos for physiological or molecular research. Amphibians contribute to one-quarter to one-third of vertebrate research, and of interest in this context is their contribution to the scientific community&#39;s knowledge of reproductive processes and embryological development. However, most of this knowledge is derived from a small number of species. In recent times, the decimation of amphibians across the globe has required increasing intervention by conservationists. The captive recovery and assurance colonies that continue to emerge in response to the extinction risk make existing research and clinical applications invaluable to the survival and reproduction of amphibians held under human care. The success of any captive population is founded on its health and reproduction and the ability to develop viable offspring that carry forward the most diverse genetic representation of their species. For researchers and veterinarians, the ability to monitor and control ovarian development and health is, therefore, imperative. The focus of this article is to highlight the different assisted reproductive techniques that can be used to monitor and, where appropriate or necessary, control ovarian function in amphibians. Ideally, any reproductive and health issues should be reduced through proper captive husbandry, but, as with any animal, issues of health and reproductive pathologies are inevitable. Non-invasive techniques include behavioral assessments, visual inspection and palpation and morphometric measurements for the calculation of body condition indices and ultrasound. Invasive techniques include hormonal injections, blood sampling, and surgery. Ovarian control can be exercised in a number of ways depending on the application required and species of interest.

The study of amphibian biology provides valuable information on the reproductive, physiological, embryological and developmental processes that drive organisms of many taxonomic groups. Here, we present a comprehensive guide on different methodologies that can be used to study ovarian control and monitoring in amphibians.

両生類における卵巣モニタリングと制御のための生殖技術

Ovarian control and monitoring in amphibians require a multi-faceted approach. There are several applications that can successfully induce reproductive ...

Cryogenic Sample Loading into a Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer that Preserves Cellular Viability

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. These sensitivity gains increase as temperatures decrease and are large enough to enable the study of molecules at very low concentrations at the operating temperatures (~100 K) of most commercial DNP-equipped NMR spectrometers. This leads to the possibility of in-cell structural biology on cryopreserved cells for macromolecules at their endogenous levels in their native environments. However, the freezing rates required for cellular cryopreservation are exceeded during typical sample handling for DNP MAS NMR and this results in loss of cellular integrity and viability. This article describes a detailed protocol for the preparation and cryogenic transfer of a frozen sample of mammalian cells into a MAS NMR spectrometer.

Presented here is a protocol for cryogenic transfer of frozen samples into the dynamic nuclear polarization (DNP) magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) probe. The protocol includes directions for rotor storage prior to the experiment and directions for viability measurements before and after the experiment.

細胞生存率を維持するマジックアングル回転核磁気共鳴分光計への低温サンプルローディング

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. ...

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits obesity and many associated diseases including cardiovascular disorders, type II diabetes, and cancer. To advance the current understanding of lipid metabolic regulation, quantitative methods to precisely measure in vivo lipid storage levels in time and space have become increasingly important and useful. Traditional approaches to analyze lipid storage are semi-quantitative for microscopic assessment or lacking spatio-temporal information for biochemical measurement. Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology that enables rapid and quantitative detection of lipids in live cells with a subcellular resolution. As the contrast is exploited from intrinsic molecular vibrations, SRS microscopy also permits four-dimensional tracking of lipids in live animals. In the last decade, SRS microscopy has been widely used for small molecule imaging in biomedical research and overcome the major limitations of conventional fluorescent staining and lipid extraction methods. In the laboratory, we have combined SRS microscopy with the genetic and biochemical tools available to the powerful model organism, Caenorhabditis elegans, to investigate the distribution and heterogeneity of lipid droplets across different cells and tissues and ultimately to discover novel conserved signaling pathways that modulate lipid metabolism. Here, we present the working principles and the detailed setup of the SRS microscope and provide methods for its use in quantifying lipid storage at distinct developmental timepoints of wild-type and insulin signaling deficient mutant C. elegans.

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows selective, label-free imaging of specific chemical moieties and it has been effectively employed to image lipid molecules in vivo. Here, we provide a brief introduction to the principle of SRS microscopy and describe methods for its use in imaging lipid storage in Caenorhabditis elegans.

刺激されたラマン散乱顕微鏡を用いた カエノラム型エレガンス における脂質蓄積ダイナミクスの無標識イメージング

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...