長期および短期の造血幹細胞またはHSC単離法は、研究者がHSCコンパートメントにおける細胞再生メカニズムと不均一性の生物学的基盤をよりよく理解するのに役立ちます。長期造血幹細胞の排他的マーカーである可能性のある転写因子Hoxb5が同定されました。これに基づいて、Hoxb5レポーターマウス系統を確立し、長期および短期のHSCを正常に分離しました。
ドナー骨髄細胞の収集を開始するには、乳鉢と乳棒を70%エタノールで滅菌し、完全に乾かします。カルシウムおよびマグネシウムを含まないPBS含有サプリメントで構成される細胞染色バッファーでそれらを平衡化します。ドナーの雄Hoxb5-tri-mCherryマウスから分離した骨を乳鉢に入れ、3ミリリットルの細胞染色バッファーを加えます。
乳棒で骨を磨き、穏やかなピペッティングで細胞塊を分解し、細胞懸濁液を100ミクロンのセルストレーナーを通して50ミリリットルのチューブに移します。溶液が透明になるまで、新しい細胞染色バッファーでこのプロセスを繰り返します。通常、明確な解決策を得るには、3回繰り返すだけで十分です。
CD45.1.2コンジェニックマウスから大腿骨と脛骨を単離した後、鋭利な滅菌ハサミで骨の両端を切りました。氷冷した細胞懸濁液バッファーを充填した5ミリリットルのシリンジを取り付けた23ゲージの針を使用して、細胞懸濁液バッファーを含む滅菌細胞培養皿に骨髄を洗い流します。穏やかなピペッティングで細胞凝集塊を分解し、P1000ピペットを使用して40ミクロンのセルストレーナーで細胞懸濁液をろ過します。
ゲーティングのセットアップでは、本文に記載されている指示に従ってサンプルを準備し、そのうち400マイクロリットルを35ミクロンのセルストレーナースナップキャップ付きの丸底ポリスチレン試験管に移します。分析前に死細胞緊張試薬を調製し、製造元の指示に従ってサンプルに追加します。次に、フローサイトメーターの電源を入れ、製造元の指示に従って分析ソフトウェアを起動します。
次に、[ロード]を押してデータの集録を開始します。ダブレット、死細胞、および系統陽性細胞を除外した後、系統陰性、cキット陽性、Sca-1陽性画分をゲートします。次に、Flk2陽性画分をゲートアウトします。
次に、Hoxb5陽性またはHoxb5陰性のpHSCをCD150陽性、CD34陰性、または低画分にゲートします。次に、600マイクロリットルのカルシウムおよびマグネシウムを含まないPBSを含む1.5ミリメートルの低タンパク質結合チューブを準備し、10%熱不活化FBSを補充します。Hoxb5陽性またはHoxb5陰性のpHSCソーティングを行うには、調製した1.5ミリリットルの低タンパク質結合チューブをソーティング回収装置にセットし、前述のゲーティング戦略を用いてHoxb5陽性またはHoxb5陰性のpHSCをチューブにソーティングします。
最初の並べ替えでは、並べ替え精度モードの歩留まりを使用します。予め調製した支持細胞を入れた96ウェルプレートを自動細胞沈着ユニットステージにセットする。次に、1.5ミリリットルの低タンパク質結合チューブをフローサイトメーターのローディングポートにセットした。
前述のゲーティング戦略を使用して、Hoxb5陽性またはHoxb5陰性のpHSCを支持細胞とともに96ウェルプレートにソーティングします。10個のHoxb5陽性またはHoxb5陰性のpHSCをソートして、自己複製能力をテストします。ドナーHoxb5-tri-mCherryマウスの骨髄分析のフローサイトメトリープロットは、系統陰性、c-kit陽性、Sca-1陽性、CD150陽性、CD34陰性、または低Flk2陰性によって定義されるpHSC画分中の細胞の約20〜25%がHoxb5陽性pHSCであることが明らかになった。
ここに示されているのは、レシピエントマウスの末梢血分析の代表的なフローサイトメトリープロットである。また、一次移植後のレシピエントマウスの末梢血解析では、移植後4週間でHoxb5陽性とHoxb5陰性のpHSCは同様のドナーキメラを示したが、Hoxb5陽性pHSCレシピエントのみで持続的な造血が観察された。Hoxb5陰性造血幹細胞は、移植後8週間で造血細胞を産生する能力を失い始めました。
二次移植解析では、Hoxb5陽性pHSCレシピエントのみが堅牢な造血を示しました。対照的に、Hoxb5陰性pHSCレシピエントマウスではドナー細胞はほとんど観察されず、Hoxb5陰性pHSCは一次移植から16週間以内に自己複製能を失ったことが示唆されました。このプロトコルには通常9〜12時間かかるため、細胞生存率を維持するために、手順全体でサンプルを可能な限り摂氏4度に保つことが重要です。
