当社は、資金調達とサポートのためのマックスプランク協会、ヒューマン·フロンティア·サイエンス·プログラム（HFSP）とベーリンガーインゲルハイムフォンに感謝します。

1。材料の準備<ol><li> FEP管の製造<ol><li>チューブを通って（段階的に以下に記載）の液体をフラッシュし、平滑末端カニューレ（ 図2B）を取り付けたシリンジを使用することにより（ 図2A）FEPチューブを清掃してください（注1）。使用手袋作業中は2点に注意してください 。お勧めCAの作品でチューブを切断。長さは1メートルと並行して、それらをクリーニング。 <ol><li>最初の繰り返し1M NaOHでチューブを洗浄します。次いで、0.5 M NaOHで充填された50ml遠心チューブに移し、チューブを10分間、それをultrasonicate。 </li><li>蒸留H 2 Oでの小流域にポリマーチューブを転送最初のddH 2 Oで、次に70％エタノールでチューブをフラッシュします。 </li><li>その後、70％エタノールで新しい遠心管にFEPチューブを移す。再び10分間この遠心管をultrasonicate。 </li></ol></li><li>粉々にきれいにFEPチューブをカット必要に応じて、約3センチメートル（ゼブラフィッシュ取り付け及びイメージングにおける使用のための典型的な長さ）とは、それらをまっすぐ。のddH 2 O（ 図2C）で満たされた新鮮な50ミリリットルの遠心管に洗浄FEP管を保管してください。 </li></ol></li><li>トリカイン原液の調製<ol><li> 97.9ミリリットルののddH 2 O中に400mgのトリカイン（MS-222）を溶解して0.4％トリカイン原液を準備します粉末が完全に溶解した後、2.1ミリリットルの1Mトリス（pH 9.0）を用いてpHを7.0に調整。光からソリューションを保護します。 -20℃での店舗分量</li></ol></li><li> 3％のメチルセルロースの調製<ol><li>後述するようにFEP管の内側コーティング3％メチルセルロース溶液を調製する。約60〜70℃までガラス瓶にE3 11を加熱およびメチルセルロース粉末を適量加える。攪拌棒を加え、4℃で撹拌するとすぐに、溶液を30℃未満に冷却されると、最終的な℃にトリカイン溶液を追加100ミリグラム/ Lのoncentration 4℃で一晩撹拌しておいてください。 </li></ol></li><li> E3 1.5％および0.1％アガロースの調製<ol><li>ガラスフラスコ中で定義されたE3の容量で低融点アガロース粉末を適量溶解させる。電子レンジでの混合物を加熱すると、アガロース溶液が均一に表示されるまで、残りの結晶がなくても、たまにはそれを振る。 </li><li> 1.5ミリリットルの反応管中の0.1％アガロース溶液1mlアリコートを調製する。分量は4℃で保存することができます</li><li>コー​​トプラスチックシャーレに1.5％の溶液を使用してください。アガロース層の厚さは、 カリフォルニアでなければなりません。 2ミリメートル。アガロースが固化した後、乾燥を防止するため、層の上にE3培地を加える。コー​​ティングされた料理は、4℃で保存することができます</li></ol></li><li>ゼブラフィッシュの作製<ol><li>確立されたプロトコル11,12によると28.5℃でゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ）大人と胚を維持し、それらを処理します。 </li><li>午後にはオスとメスの魚を設定し、分周器を使用して区切ります。魚の交配をタイムアウトするには、次の朝、分周器を取り外します。 </li><li> E3で満たされた皿に胚を収集し、実体顕微鏡を使用してそれらを検討する。 </li><li> 24 HPF（またはあなたの興味の発達段階）で、蛍光発現のためのゼブラフィッシュ胚を選択して、新鮮な、E3で新しい皿に肯定的なものを転送します。 </li><li>慎重に2鋭い鉗子（ 図2D及び2E）を使用して胚をdechorionate。オープンにして引き裂き、それをやってのける絨毛膜と第二の鉗子を取得し、保持するための最初の鉗子を使用して、1の点に注意してください 。実体顕微鏡の助けを借りて、この手順を実行します。 </li></ol></li></ol> 2。多層取り付け<ol><li> FEPチューブをコーティング<ol><li>注射器に平滑末端カニューレを取り付けます。掃除の一端に約3ミリメートルを慎重にカニューレを挿入し、一枚をカットFEPチューブ（ 図2Fおよび2G）注1：使用手袋、チューブの任意の曲げや絞りを避ける。 </li><li> 3％メチルセルロースにFEPチューブの自由端を浸して水でチューブを埋める。 </li><li>ゆっくりと注射器を押すことによって、メチルセルロースをリリース。ソリューションを捨てる。 </li><li>繰り返しは、E3を使用して2.1.2と2.1.3ステップ注1：コーティングされたチューブはすぐにマウントするために使用される必要がある。 </li></ol></li><li>アガロースにゼブラフィッシュを転送<ol><li>ヒートブロックで70℃に0.1％アガロースの1アリコートを加熱。簡単にボルテックス反応管をして38℃（ 図2H）に設定されたヒートブロックに転送。 </li><li>ヒートブロックから反応管を取り出し、それが簡単にクールダウンしましょう​​。再び133から200 mg / Lの渦の最終濃度（ 図2I）にトリカインを追加します。 </li><li>絨毛膜を除去ゼブラフィッシュ胚とtransfeのいずれかを選択します。Rそのガラスパスツールピペット（ 図2Jおよび2K）を使用して、予熱した0.1％アガロースで反応チューブに注1：できるだけ追加のE3を転送してみてください。 </li></ol></li><li>ゼブラフィッシュの取り付け<ol><li>注射器に接続されたFEPチューブ（ 図2L）で胚を取る。チューブは、チューブの両端に、管の開口部の方を向いて頭を近接して配置胚を、0.1％アガロースで完全に充填する必要があります（注1）。魚を取って前にいくつかのアガロースを取るようにしてください。 注2：泡を避けるために、注射器には非常に慎重に引き抜いてください注3：。その内容（ 図2M及び2N）の漏れを回避するために、水平方向にチューブを保管してください。 </li></ol></li><li>チューブを差し込む <img alt="図2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig2highres.jpg"SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51119/51119fig2.jpg&quot; /&gt; 図2。マルチレイヤの準備の前に、ケーブルドラム上のゼブラフィッシュ胚。A）フッ化エチレンプロピレン（FEP）チューブ用マウント。B）付属の平滑末端カニューレを注射器を。清掃C）AとFEPチューブをカット。24 HPFのD、E）Dechorionation溶けたのゼブラフィッシュ胚。F）平滑末端カニューレにチューブを取り付ける。G）に取り付けられたカニューレとチューブとシリンジH）0.1％の一定量のアガロース反応管内部のヒートブロックにそれを転送している間、私）ボルテックスFEPチューブ。M、N）にアガロース周辺融解したアガロース胚の、L）摂取への胚のガラスピペットを用いて、絨毛膜を除去胚のアガロース、J）の取り込み。、K）転送FEPチューブ内部のゼブラフィッシュ胚。 <stroNG&gt; O）標本とカニューレとの間のチューブを切断。P）アガロースコートディッシュを使用することにより、チューブを差し込む。Q）を接続し、チューブ内部の胚。R）メタルホルダーの最後のサンプル調製。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig2highres.jpg" target="_blank">するには、ここをクリックしてください拡大表示する。</a> <ol><li>カニューレ（ 図-20）からチューブをカットするカミソリの刃を使用してください。 </li><li>ゆっくりとチューブ（ 図2P）をプラグインするプラスチック皿の中の1.5％アガロースの層全体を通して、魚の入ったチューブの端を貼り注1：保持して気泡の形成を避け、ストレートプラグ表面を取得しようチューブ正確に垂直アガロース面への注意2：素敵なプラグインを取得するために、わずかにチューブを回転させます。 </li><li>乾燥を防ぐために、E3で1.5ミリリットル反応管に取り付けられた標本を保管してください。サンプルはnです画像化される準備ができOW。イメージングの前に、魚は右のプラグ（ 図2Qおよび2R）の上に座っているかどうかを確認してください。また、封入剤と同じ濃度のイメージングチャンバー内の媒体にトリカインを追加してください。 </li></ol></li></ol>

<ol>
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Biophoton. , 1-11 (2012).</li><li>Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+microscopy+for+real-time+developmental+biology.">Light sheet microscopy for real-time developmental biology.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 21 (5), 566-572 (2011).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li><li>Keller, P. J., Stelzer, E. H. 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Pharmacol. 33 (2), 313-317 (1975).</li><li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+for+bead-based+registration+of+selective+plane+illumination+microscopy+data.">Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data.</a> Nat. Methods. 7, 418-419 (2010).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

このような光シート顕微鏡などの高度な顕微鏡技術は、数日間にわたって高い時間·空間分解能で画像データを記録するために私達を可能にするだけでなく、改善するためのサンプル実装技術を必要とする。私たちは、ゼブラフィッシュの開発の光シート顕微鏡用多層実装の詳細なプロトコルを提示する。この方法は、実装が簡単であり、我々は日常的に私たちの研究室で使用します。 FEPチューブ私たちの実装戦略の重要な構成要素は、ポリマーフッ化エチレンプロピレン（FEP）製のチューブである。私たちは、主に水と同様、したがって理想的に水浸漬の目的と水性媒体を必要とする試料の光シート顕微鏡に適して1.338の屈折率のFEPを使用することにしました。 0.8ミリメートル、内径0.4mmの肉厚を有するチューブは1.6mmであっに適した典型的な試料ホルダーと共に使用することができる、非常によくフィット現像ゼブラフィッシュ毛細血管提示実装方法のための私たちの最初の選択肢です。私たちは、自作のセットアップにだけでなく、商用システムカールツァイス顕微鏡による「Lightsheet Z.1」でそれらを徹底的にテストし、FEP管は、長期的な安定性を提供し、光学性能への最小限の影響を与え、非蛍光10であることがわかった。しかしながら、それらは、例えば、検体をクリアし、異なる屈折率を必要とする試料とするアプリケーションには適していない。 チューブなどのFEP製箔は直径と厚さの様々な利用可能です。また、FEPは260℃で溶融し、このように特注のサンプルの取り付けをサポートするため、事実上無限の可能性を提供していますことができます。ポリマーチューブは、洗浄プロトコルは、最良の光学的品質を確保するためのいくつかのステップを組み込んだ理由である、非滅菌供給される傾向にある。メチルセルロースによるコーティングは、成長しているゼブラフィッシュ胚のどの部分がポリマーに付着しないようにします。 0.1％アガロースのための決定は、アガロースおよびメチルセルロース10の異なる濃度での成長率と不動の広範なテストに基づいています。 0.1％以上のアガロース濃度は、すでに24のHPFゼブラフィッシュの成長率に深刻な影響を示した。さらに私たちは、麻酔薬のトリカインの低用量を使用しています。トリカインブロック活動電位、従って脳と筋肉との間の信号伝達を阻害し、筋肉の収縮を抑制する16。 133から200 mg / Lの濃度は24〜72 HPF間ゼブラフィッシュの十分な固定化を保証します。しかし、トリカイン、その他の麻酔薬は、我々は、心臓性浮腫などのショーの用量依存性の副作用をテストした。さらにトリカインの必要な投与量は、胚の発達段階に応じて変化する。したがって、我々は、画像化される発達段階に必要な量にトリカイン濃度を低下させるお勧めします。最高のperformanを確保するために、CEおよび副産物毒性の形成を防止するため、新たに調製されたか、解凍トリカイン原液は、使用される光から保護し、30℃以上に加熱されないべきである FEPチューブ内の埋め込みにも、特定のニーズを考慮して封入剤を簡単に修正することができます。心のタイムラプスイメージングのために、我々は3％のメチルセルロースおよび100 mg / Lのトリカインの代わりに、0.1％アガロースと取付用200 mg / Lの使用をお勧めします。メチルセルロース、アガロース、従ってそれ自体で高い不動を提供し、より少ないトリカイン胚の閉じ込めを確保するために使用する必要がある0.1％よりも粘性である。 トリカインは30℃以上の温度に敏感であり、また、パフォーマンスや胚の可能性けいれんの減少につながる、イメージングチャンバー内に媒体によって希釈することができる。そのため、搭載された試料が浸漬された画像媒体でもトリカインを使用してください。あなたの実験は、それ以上の使用を必要とする場合温度は、我々は常に灌流システムを使用して、または手動つの時間点の間のチューブ及びシリンジのいずれかで撮像チャンバ内の培地を交換することをお勧めします。 重要なステップサンプル実装プロセス中の重要なステップは、チューブに、検体の摂取量とアガロースプラグの挿入である。摂取量は、その後に変更することが面倒である胚の初期位置を定義します。複数の標本をマウントできなければならないと取付品質は実体顕微鏡を使用して監視する必要があります。サンプルの向きが十分でない場合、これは多くの場合、胚をねじるように、検体を策定し、プランジャーのその後の動きを回避する速度を変化させることは役立つことがあります。 1.5％アガロースプラグを、0.1％アガロースの漏れを回避する必要がある。管内のプラグの表面には、開発中のサンプルの方向に影響を与えないように平らにしてください。良いサーフィンを達成するためにエース、アガロース層の異なる厚さを試験する必要があり、チューブは、表面に垂直アガロースに入れることが必要である。チューブを少し回転させて、チューブを抜くことは慎重に皿からプラグを解放します。取り付けの質は、イメージングの前に実体顕微鏡でチェックする必要があります。 マルチビュー画像シート光顕微鏡の1つの主な利点は、多眼画像処理、試料を回転させ、複数の角度からZスタックを取得し、登録し、その後、それらを融合する機能です。 3D空間でZスタックを登録する確立された方法は、受託者のマーカー17などの試料の周囲の蛍光ビーズを使用したビーズベースの登録である。しかしながら、この方法は、このような1.5％アガロース等の固体封入剤に依存しているので、ここで紹介する多層実装と互換性がないように思われる。しかし、いくつかの代替ソリューションは、アプリケーションに応じて動作する。まず、蛍光ビーズは、缶取得中に視野内にある必要があり、アガロースプラグに組み込むこと。第二に、ステージ位置は、蛍光ビーズで1.5％アガロースカラムを用いて、実際の実験の前に較正することができる。第三に、このような蛍光核のような代替のマーカーは、互いに対してのzスタックの位置を同定することができる。 蒸発典型的な光シート顕微鏡のセットアップは避けられないが、媒体の蒸発につながるオープンな試料室を使用しています。媒体は、封入剤の蒸発を制限するために、試料の生存、および光学系と試料との間の正確な屈折率のために必須であるので、蒸発を防ぐために、以下の対策の一つまたは複数をとることをお勧めします。まず、チャンバー内の媒体は、常に灌流システムによって交換することができる。第二に、媒体を手動で再充填することができる。第三に、チャンバ蓋又は可撓性ホイルで覆うことができる。 <pクラス= &quot;jove_step&quot;&gt;酸素供給ポリマーFEPは、化学的に不活性ガスへの非透過な化学物質の多種多様に耐えるように開発されたため、堅牢でました。多層実装酸素のみの場合アガロースプラグおよびアガロース - 空気界面を貫通するが、ポリマー管を支持することなく、1.5％アガロースで実装と比較した場合の多層実装の酸素供給が激しく低い場合には、図示されないままでできる。ゼブラフィッシュ形態は、多層実装が影響を受ける前に、しかし、1.5％アガロースに取り付けのみ約2時間使用することができ、長期的なイメージングのための優れた全体的な解決策になると思われる。 開発の初期段階を画像化多層実装は現在、ゼブラフィッシュより古い24 HPFのタイムラプス光シート顕微鏡のための私達の標準的な埋め込み技術となっている。それに加えて、我々はまた、初期の段階の胚のイメージングのために、ポリマーのチューブを使用しています。 Embryosは、それらの絨毛膜中に残存し、1mmの内径FEPチューブに取り付けられ、E3が充填されている。ゼブラフィッシュは、自由に絨毛膜の内部で開発することができますし、まだよくシート光顕微鏡を用いて画像化することができる。 見通し提示された多層サンプル実装は、ゼブラフィッシュとのリアルタイム発生生物学のためのシート光顕微鏡の可能性を最大限に解き放つ。これは、簡単にこのような光投影トモグラフィ（OPT）および他の生物のような他の顕微鏡技術を採用することができる。私たちは、標準サイズのFEPチューブは、特定のニーズに合わせたサンプル実装技術に向けた単なる最初のステップであると考えています。

胚形成の間の複雑なイベントや相互作用を理解するためには、発生生物学の研究は、全生物のin vivoイメージングへの単一細胞や臓器の顕微鏡から移動し、より多くのです。伝統的な顕微鏡技術は、典型的には、長期間にわたって急速イベントを追跡する空間および時間分解能を提供できず、しばしば漂白または試料1の光毒性効果を引き起こす。我々は、他のシート光顕微鏡（ 図1）は、ゼブラフィッシュ2-4 のin vivoイメージングのための理想的な技術であることがわかった。検出軸に直交するレーザ光 ​​の薄いシート試料の照明は、高い空間分解能と同様に最小化された光毒性5による高速光学切片を提供しています。同時に、これにより、独自の光学配置に、ペトリ皿または培養チャンバを用いて従来のサンプル実装技術は適していない。典型的な光の中でモータつの並進および回転運動は、試料を保持するシート顕微鏡は、それが正確に位置決めすることができるように、なって、任意の方向から見た。光シート顕微鏡用に過去の試験片では、多くの場合、ガラスキャピラリー6,7内部の1〜2％アガロース中に埋め込 ​​まれています。この場合、埋め込まれた検体と固化したアガロースシリンダは、イメージングのための水のような媒体で満たされた試料室にガラス毛細管の外に押し出される。アガロースは水に近い屈折率を有するため、水補正された照明および検出光学系を容易にし、生体内光シート顕微鏡に最適です。試料は、剛性アガロース中に閉じ込められ、短時間でよく撮像することができるが、数時間のために、7,8撮像する際の変更形態形成および胚の成長が強く損なわれている。他のアプリケーションのためのソリューションは、非侵襲的、長期タイムラプスゼブラフィッシュに、9を開発されているが<html>シート光顕微鏡のイメージングの可能性は、従来の1.5％アガロース埋め込みを使用して悪用されることはありません。 したがって、我々は、ゼブラフィッシュ胚10 のin vivo光シート顕微鏡のための新しいマウントの戦略を開発しました。試料は、光学的に透明なポリマー、フッ素化エチレンプロピレン（FEP）からなる管の内部を200mg / Lのトリカインアガロースを0.1％に装着されている。埋め込まれた胚は、通常、媒体の低粘度のために開発しています。同時に、FEPチューブは実験期間中培地およびサンプルを閉じ込める。ここでは、従来のプロトコルを介して、その利点を反映した新たな実装技術と現在のデータの詳細なプロトコルを提供する。私たちは、法のゼブラフィッシュの開発を継続的に超える2日間にわたって高い空間分解能と時間分解能で画像化できることを実証している。 「FO：SRC = &quot;5インチ/ files/ftp_upload/51119/51119fig1highres.jpg&quot; SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51119/51119fig1.jpg&quot; /&gt; 図1光シート顕微鏡の原理。フッ素化エチレンプロピレン（FEP）製のチューブに装 ​​着ゼブラフィッシュは、翻訳されたと検出対物レンズの焦点面を介して回転させることができる。レーザ光（光シート）の薄いシートは、検出対物レンズの焦点面内の照明対物レンズによって投影された試料の薄膜のみの光学部を照明する。放出された蛍光シグナルは、検出目的によって収集し、カメラチップに記録される。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1097">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:268px;">Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) tubes</td>
			<td style="width:143px;">Bola</td>
			<td style="width:113px;">S 1815-04</td>
			<td style="width:573px;">0.8 / 1.6 mm inner / outer diameter, other sizes available</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Omnifix-F Solo 1 ml Syringe</td>
			<td style="width:143px;">B. Braun Melsungen AG</td>
			<td style="width:113px;">9161406 V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sterican Single-Use Cannula, blunt</td>
			<td style="width:143px;">B. Braun Melsungen AG</td>
			<td style="width:113px;">9180109</td>
			<td style="width:573px;">0.8 x 22 mm, other sizes available, outer diameter of cannula has to fit inner diameter of FEP tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ml Polypropylene Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:143px;">Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 M NaOH</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 M NaOH&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70% EtOH</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Methylcellulose</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td>M0387</td>
			<td>supplied as powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">E3 medium (for zebrafish embryos)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">1.5 ml Reaction Tube</td>
			<td style="width:143px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:113px;">3810X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Agarose, low gelling temperature</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td>A9414</td>
			<td>supplied as powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Petri Dish</td>
			<td style="width:143px;">Greiner</td>
			<td>633180</td>
			<td>plastic, 94 x 16 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">Tricaine</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td>E10521</td>
			<td style="width:573px;">synonyms:&#160; Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, MS-222, TS 222, Tricaine methanesulfonate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">10x/0.3 W Microscope Objective Lens</td>
			<td style="width:143px;">Leica</td>
			<td style="width:113px;">HCX APO L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">EMCCD Camera</td>
			<td style="width:143px;">Andor Technology</td>
			<td style="width:113px;">iXon 885 EMCCD</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multilayer mounting for long-term light sheet microscopy of zebrafish

シート光顕微鏡は、ゼブラフィッシュの胚発生を研究するための理想的なイメージング技術である。により、最小限の光毒性及び漂白するためには、数日までの数時間にわたる長期タイムラプスイメージングに特に適している。しかし、適切なサンプルの実装戦略は、閉じ込めとサンプルの正常な発達の両方を提供することが必要である。多層は、取り付け、光学的に透明なチューブに低濃度のアガロースを使用して新しい埋め込み技術は、今、この制限を克服し、リアルタイム発生生物学のためのシート光顕微鏡の可能性を最大限に解き放つ。

ゼブラフィッシュ血管系の開発の複数日イメージング長期光シート顕微鏡用多層取り付け戦略の利点を実証するために13ゼブラフィッシュ：我々は1 DPF TG（GFP kdrl）を使用します。目的は、画像に2日間にわたって全体のゼブラフィッシュにおける血管系の開発である。ゼブラフィッシュ胚は、ポリマーコーティングされたチューブの内側メチルセルロース0.1％アガロースに取り付けた。ここでは、ゼブラフィッシュは、取り付け媒体によって限定されるものではなく、普通に開発することができます。その頭がレイズ、尾が伸び、血管発芽（ 図3）妨害されずに表示されます。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51119/51119fig3.jpg" /> 図3。ゼブラフィッシュ血管系の発達の複数日イメージング。multilaの血管系13ゼブラフィッシュは2日間にわたって光シート顕微鏡で妨害されずに開発する：リアルは1 DPF TG（GFP kdrl）に取り付け。 488nmのレーザー光シートは、蛍光を励起信号が10X/0.3 W目的とEMCCDカメラを用いて検出した。 Zスタックは10分ごとに4隣接する位置に取得し、その後、フィジー15で縫製された。時間点のサブセットの最大強度投影が示されている。スケールバー：500μmで<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig3highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。</a> 初期のゼブラフィッシュ胚のイメージングここでは、受精後の最初の日中の初期のゼブラフィッシュ胚発生の光シート顕微鏡用の取り付けのサポートとして、FEP管の能力を示しています。 8 HPF TG（H2A：GFP）14ゼブラフィッシュ胚はIで、E3で満たされたチューブ内の完全な絨毛膜を装着した1ミリメートルのnner径。つまり、絨毛膜のわずかなクランプになり。胚形成中にすべての発生過程を装着することにより、影響を受けず、最適にシート光顕微鏡を用いて可視化することができる。この例では、12時間（ 図4）の過程で、試料を画像化した。 1.5％アガロース中の絨毛膜なしで、伝統的なマウントを使用する場合は、このような卵黄と正中に沿った組織の肥厚の増加、伸びなどの初期胚発生時の典型的な形状の変化は、抑圧されることになる。 <img alt="図4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51119/51119fig4.jpg" /> 図4初期のゼブラフィッシュ胚発生のイメージングTG（H2A：GFP）。14ゼブラフィッシュの初期胚発生を通過する。 488nmのレーザー光シート励起GFP蛍光シグナルを検出した10X/0.3 W目的とEMCCDカメラで。 2角度からZスタック12時間にわたって3分毎に取得した。タイムラプスのサブセットの正規化された最大強度投影が示されている。全く麻酔が使用されなかったとして、取得中の胚のけいれんから19 HPF結果、可視モーションブラー。スケールバー：150μmで<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig4highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。</a>

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Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

ゼブラフィッシュの胚の発達は、低濃度のアガロースで光学的に透明なポリマーチューブに埋め込まれている光シート顕微鏡で日間にわたって追跡することができる。

多層はゼブラフィッシュの長期シート光顕微鏡用に取り付け

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

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Research

JoVE Journal

Biology

18.7K ビュー.  Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics. ゼブラフィッシュの胚の発達は、低濃度のアガロースで光学的に透明なポリマーチューブに埋め込まれている光シート顕微鏡で日間にわたって追跡することができる。 

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Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Actually what I'm gonna do, mount it in here first and then swap out You. So now I'm gonna aspirate try and be as gentle as possible.Okay. A few seconds just holding.Okay.Alright.So the important features of our lifestyle imaging grid are that, so it's an inverted scope, which means the objective, the samples here in the objective is underneath. So the objective is pointing up and the whole scope, or practically the whole, practically the whole scope, including the objectives and the sample are at 37 degrees. So everything in this plastic box is at 37 degrees.And right on top of the stage we have an air and CO2 mix. That is 5%CO2. So the idea is that the sample is actually in a cell, it's like a cell incubator.And so we have, this is our mixer for the air and the CO2 and, and it gets humidified and heated and then piped onto the, the sample on the stage.Okay. And today we're just gonna be doing fluorescence one channel GFP fluorescence. This is the hose that the CO2 and 5%CO2 goes in and it just fits into the stage holder.That's important. And then we can close these, take these down, and then we go to our first position. And what I'm gonna do is go to the first field, which is my control sample, and I'll pick positions based on what I see on the screen.So I just make sure I actually look into the microscope in each new, well, because the focal plane for each of the wells is different, the, the dish is not perfectly flat on the bottom. So you will need to make fine adjustments when you move from well to the well. So right now I'm on the first, well, what I'll do is I'll focus, so I just hit, I just told, I just turned on the light, the transmitted light for the microscope.And I have make sure all the light is going to the eye pieces. And so I just look in, make sure I get a nice clean field. And then what I'll do is turn that light off, turn the fluorescence light on, make sure the cells that I'm looking at look healthy and they're not apoptotic.And, and I turn that off. And what I do next is send, so now I'm gonna start picking positions, which means I have to te send the light path to the camera. This is the camera right here.So I tell the microscope to send all the camera, they don't see anything in the eye pieces. What I'll do is in the software controlling the microscope, I'll choose the right filter set, which for our purposes is psy. And then set an exposure time.And I know these cells very well and I know that they take a 0.2 second exposure time. So I tell, that's what I tell the software to do. And what I'll do is hit focus.This is, and it's basically just alive. The, A light will turn on and you can, oh, I don't know if you can see cells, but the reason this is a good field is because there's, all the cells are, even in terms of their fluorescence, There are no apoptotic cells. Apoptotic cells tend to be very bright and there's no dirt or schmutz in the field.And you can see that they're actually, this is a metaphase cell and that's a metaphase cell, that's a cell that's probably just exited mitosis. And I can just tell that because it looks like those are, those two sets of chromatin are very nicely oriented to each other. Like they just exited an face.So that's a good field. So, and now that I know that the exposure time and the filter set is correct, and this is gonna be software specific, I'll go and I'll take positions and now the software has memorized the X, Y, Z position of that field. And then when I do pick another field, it's, and I'll, so when I'm picking, when I'm picking new fields, but in the same, well, I'll use the, I'll move the i'll, I'll turn the shutter, I'll open the shutter and I'll look to see what I see on the screen and I'll pick fields based on that versus looking in the field.So I don't see any of my tonics in there. But again, even nicely centered, these cells will go through my PS I continue, here's a good example. Here's a good example of what I would avoid that, see how bright that is?That's very bright. That's probably remnants of an apoptotic cell. And the reason I would avoid that is because since it's so bright, when the software auto focuses, it will autofocus just on that and it won't be in the same plane as all these other cells.And so I won't get any information from that field. That looks nice. There's a, this is a pro metaphase right here, That's A metaphase.So, and I'm gonna take three positions per well. So that was three positions and now I'm going to go to my next Well, so you can, so what I will probably do is take images every 10 minutes. So it's a compromise.Lifestyle imaging is always a compromise, right? You have to image, you have to keep the cells healthy, especially if you're interested in mitosis. So you have to minimize their exposure to the fluorescent line.And, but you wanna get information. So you have to take images, you have to, so you have to compromise, you have to make a choice about what you want to capture, what kind of information you wanna capture. For our purposes, mitosis tends to take about an hour.So if we're taking 10 minute intervals, that's pretty good. We see prophase, we see metaphase, we see anaphase, and we can, we can see when there are, there are treatments or drugs or siRNAs that affect those specific cell cycle stages. So for our purposes, that's enough, but we always want more.We always want more positions or finer time and interval or something like that. So it's a compromise. So, and then I'll hit start.And so our software, it does an autofocusing pass on the first pass. So once I hit start, it should start auto autofocusing and you'll see the shutter open, open and close between auto focusing. So I'll hit start.So that's the shutter opening and closing. The Z motor is engaging and it's actually trying to find the plane with the most contrast, which will be the most in focus. You can actually see on the screen going in and out of finding the best plane of focus that might be worrisome.So what it does is it, it drives the Z motor to find the best, the most in focus plane focus, well the most in image. And then it acquires picture there and then it learns that Z position. And then we'll use that Z position for the next 12 passes.And then we'll do the auto focusing pass again. What Kind of experiments do they do? Okay, so our lab is mostly interested in understanding what regulates mitic progression, or at least I'm most interested in understanding that.So with live cell imaging and especially our multi position, long-term imaging scope, you can take, you can film cells for two or three days entering anding mitosis, and you can image multiple rounds of mitosis so you can understand. And then you can put drugs or RNAs or any kind of perturbations on the cells that you would like to study. So you can understand how, how those drugs or, or genes are, are important in regulating mitotic progression.Because it's not fixed cell work and live cell work, you can understand what, when you need to have a perturbation to affect mitosis or what stage of mitosis is affected. So it's really powerful in that respect. What, what are the main technical elements of this experiments?What are the possible problems? Well, the biggest problem besides getting the rig set up, getting the rig set up is not trivial. A lot of people have the rig, but just making sure it works well for your application.The financial element is not, you know, is not small. So there's the setting up of the apparatus and then, and then once you gather the data, there's a real data analysis issue. It takes these movie, if, so, if you're gathering 40 movies each with 30 cells, so you have 40 in 40 fields that you just filmed and each of those fields has 30 cells, then you have to sit down with each one of those movies and look at each one of those cells in that movie.So it takes a really long time to do data analysis. And that's, so it takes a week to analyze data that it took you two days to collect. So there's a, that's a very big obstacle in terms of gathering lots of data.So it's not, while it's high throughput data collection, it's not high throughput analysis. So what would you make to make this experiment really high throughput? So our lab is in the process of developing a program that does the data analysis automatically.And it's a pretty decent program. It's not perfect. The human eye is always better, but it's getting there.So What are the interesting application of this experiment? Maybe other fields you can mention? Besides cell division?You mean for the, oh, for the live cell imaging? Yes.Well, you can do cell motility assays. You can, depending on the, the microscopy that's involved, you can, you know, look at how cells, you could look at tumor development if you really wanted to.But there, you, you're, if as long as you have the right imaging set up, you can, you're pretty much not limited in terms of anything. Our scope happens to be just a wide field and we use 20 by 20 x objective. So it's a pretty low resolution set up, but that's sufficient for what we need to see.So there are, but there definitely aren't, you wouldn't be limited. Anything that has any dynamic kind of experiment, which is biology, it would be, would really benefit from lifestyle imaging. So calcium imaging, although you couldn't do it on our apparatus, that's a live cell.You definitely need live cell imaging for that. Like I said, patient assays, motility assays, those kinds of things would really benefit from live cell imaging. Would you like to tell a few words about your previous experience?How long do you work on these techniques? What do you you work on before? Wow.So in my PhD I didn't work.I did a lot of confocal microscopy, but no lifestyle imaging. And so during my postdoc I was, I helped Dr.King get this apparatus that, that we just used to set up these fragment, get that up and running. And, and so during my postdoc, I had a lot of experience with both widefield with TimeLapse imaging on our scope, which is the widefield and also TimeLapse imaging with confocal microscopy.And I would say that it's really powerful. You get a lot of information, but it's not easy to get working perfectly. So it really requires a lot of attention and a lot of attention to details at every little step of the process.And, and then you still have problems. So it's a tough application, but you can really get, if, if it's what you need to have to, to study your problem, your scientific problem, then it, it's invaluable in that respect, but it's tough. So find someone who knows what they're doing and use them.That's my advice. So good.

広視野顕微鏡を用いて長期的なイメージング哺乳類細胞

生物学

Application of Light-cured Dental Adhesive Resin for Mounting Electrodes or Microdialysis Probes in Chronic Experiments

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these acrylics do not bond to the bone, screws have been used as anchors. However, in small experimental animals like finches or mouse, their craniums are very fragile and can not successfully hold the anchors. In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium. Therefore, anchor screws are not required and surgical field can be reduced considerably. Past experiences show that the bonding effect maintains more than 2 months. Conventional resin's window of time when the materials are pliable and workable is a few minutes. However, the window of working time for these dental adhesives is significantly wider and adjustable.

In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium.

慢性実験における実装電極やマイクロダイアリシスプローブ用光重合型歯科用接着性レジンの応用

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature and genome sequence database. Cultured Drosophila S2 cells, the product of disassociated 20-24 hour old embryos1, possess all these properties. Consequently, S2 cells are extremely well-suited for the analysis of cellular processes, including the discovery of the genes encoding the molecular components of the process or mechanism of interest. The features of S2 cells that are most responsible for their utility are the ease with which they are maintained, their exquisite sensitivity to double-stranded (ds)RNA-mediated interference (RNAi), and their tractability to fluorescence microscopy as either live or fixed cells.
S2 cells can be grown in a variety of media, including a number of inexpensive, commercially-available, fully-defined, serum-free media2. In addition, they grow optimally and quickly at 21-24&deg;C and can be cultured in a variety of containers. Unlike mammalian cells, S2 cells do not require a regulated atmosphere, but instead do well with normal air and can even be maintained in sealed flasks.
Complementing the ease of RNAi in S2 cells is the ability to readily analyze experimentally-induced phenotypes by phase or fluorescence microscopy of fixed or live cells. S2 cells grow in culture as a single monolayer but do not display contact inhibition. Instead, cells tend to grow in colonies in dense cultures. At low density, S2 cultures grown on glass or tissue culture-treated plastic are round and loosely-attached. However, the cytology of S2 cells can be greatly improved by inducing them to flatten extensively by briefly culturing them on a surface coated with the lectin, concanavalin A (ConA)3. S2 cells can also be stably transfected with fluorescently-tagged markers to label structures or organelles of interest in live or fixed cells. Therefore, the usual scenario for the microscopic analysis of cells is this: first, S2 cells (which can possess transgenes to express tagged markers) are treated by RNAi to eliminate a target protein(s). RNAi treatment time can be adjusted to allow for differences in protein turn-over kinetics and to minimize cell trauma/death if the target protein is important for viability. Next, the treated cells are transferred to a dish containing a coverslip pre-coated with conA to induce cells to spread and tightly adhere to the glass. Finally, cells are imaged with the researcher's choice of microscopy modes. S2 cells are particularly good for studies requiring extended visualization of live cells since these cells stay healthy at room temperature and normal atmosphere.

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Drosophila Schneider (S2) cells are an increasingly popular system for the discovery and functional analysis of genes. Our goal is to describe some of the microscopic techniques that make S2 cells such an increasingly important experimental system.

の準備ショウジョウバエ</em光学顕微鏡用> S2細胞

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

甲殻類との長期致死毒性試験アルテミアfranciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces photo-bleaching and phototoxic effects compared to confocal microscopy, while providing 3D images with subcellular resolution. Here we present the setup of a light sheet based microscope, which is composed of an upright microscope and a small set of opto-mechanical elements for the generation of the light sheet. The protocol describes how to build, align the microscope and characterize the light sheet. In addition, it details how to implement the method for in toto imaging of C. elegans embryos using a simple observation chamber. The method allows the capture of 3D two-colors time-lapse movies over few hours of development. This should ease the tracking of cell shape, cell divisions and tagged proteins over long periods of time.

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

This protocol describes the setup of a light sheet microscope and its implementation for in vivo imaging of C. elegans embryos.

のための簡単​​なシート光顕微鏡を設定する<em&gt;トトで</em&gt;イメージングの<em&gt; C.虫</em&gt;開発

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

共焦点および多光子顕微鏡を用いて5蛍光タンパク質によってマーク造血幹細胞および前駆細胞の生体内でクローン追跡で

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.

This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

ゲルの表面上に成長する植物の根の光シート蛍光顕微鏡

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents in the treatment of several diseases. The development of new, innovative strategies for miRNA/siRNA therapy is based on an extensive knowledge of the underlying mechanisms. Recent data suggest that small RNAs are exchanged between cells in a gap junction-dependent manner, thereby inducing gene regulatory effects in the recipient cell. Molecular biological techniques and flow cytometric analysis are commonly used to study the intercellular exchange of miRNA. However, these methods do not provide high temporal resolution, which is necessary when studying the gap junctional flux of molecules. Therefore, to investigate the impact of miRNA/siRNA as intercellular signaling molecules, novel tools are needed that will allow for the analysis of these small RNAs at the cellular level. The present protocol describes the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) microscopy to elucidating the gap junction-dependent exchange of miRNA molecules between cardiac cells. Importantly, this straightforward and non-invasive live-cell imaging approach allows for the visualization and quantification of the gap junctional shuttling of fluorescently labeled small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution. The data obtained by 3D-FRAP confirm a novel pathway of intercellular gene regulation, where small RNAs act as signaling molecules within the intercellular network.

Here, we describe the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) for the analysis of the gap junction-dependent shuttling of miRNA. In contrast to commonly applied methods, 3D-FRAP allows for the quantification of the intercellular transfer of small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution.

3D-FRAP顕微鏡によるmiRNAのギャップジャンクション依存的転写の解析

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents ...

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because the larval body wall and most internal organs are transparent. However, continuous live imaging of intact Drosophila larvae for longer than 30 min has been challenging because it is difficult to noninvasively immobilizeimmobilizing larvae for a long time. Here we present a larval mounting method called LarvaSPA that allows for continuous imaging of live Drosophila larvae with high temporal and spatial resolution for longer than 10 hours. This method involves partially attaching larvae to the coverslip using a UV-reactive glue and additionally restraining larval movement using a polydimethylsiloxane (PDMS) block. This method is compatible with larvae at developmental stages from second instar to wandering third instar. We demonstrate applications of this method in studying dynamic processes of Drosophila somatosensory neurons, including dendrite growth and injury-induced dendrite degeneration. This method can also be applied to study many other cellular processes that happen near the larval body wall.

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

This protocol describes a method for mounting Drosophila larvae to achieve longer than 10 h of uninterrupted time-lapse imaging in intact live animals. This method can be used to image many biological processes close to the larval body wall.

長期経過イメージング用のショウジョウバエ幼虫の取り付け方法

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because ...