このプロトコルにより、成体マウス後根神経節培養におけるニューロンの数を増やすことができます。これは、特定の応答に対する神経細胞の寄与を決定するのに役立つ可能性があります。基本的なDRG培養プロトコルにイムノパンニングステップを追加しました。
主な利点は、非神経細胞に対して選択することです。主要なDRG培養に不慣れな場合は、解剖を練習してできるだけ多くのDRGを取得し、できるだけ多くの神経を整えるのが最善です。まず、培養プレートのコーティングに使用したポリD-リジンを吸引し、組織培養水でプレートを3回洗浄します。
蓋を傾けて開き、表面を完全に乾かします。各ウェルの底をコーティングするのに十分なラミニンをプレートに塗布し、摂氏37度のインキュベーターに入れます。CD45、PDGFR-β、およびO4の事前に準備したパンニング皿をD-PBSで洗浄します。
CD45ディッシュには、5ミリリットルの0.2%BSAと20マイクロリットルのCD45一次抗体を加えます。PDGFR-βディッシュの場合、5ミリリットルの0.2%BSA含有プレートに15.2マイクロリットルのPDGFR-βを加える。O4ディッシュの場合、2ミリリットルのO4ハイブリドーマを3ミリリットルの0.2%BSAに加え、さらに100マイクロリットルの4%BSAを加えて、最終的なBSA濃度が0.2%のままになるようにします次に、安楽死させたマウスに30ミリリットルの0.9%氷冷生理食塩水を灌流します。
灌流を確実にするために肝臓の色の変化を観察してください。前足と後足を発泡スチロールのステージに固定し、きれいなかみそりの刃を使用して脊柱を後ろから露出させます。背側脊柱の両側を約半分の深さまで切り込み、柱の背側半分を切除して脊髄を露出させることにより、椎弓切除術を行います。
神経をそっと切って脊髄を取り除くか、神経の完全性を維持しながらコードをそっと横に押します。解剖顕微鏡下で、脊髄神経根を使用して、脊柱の両側からすべての後根神経節(DRG)を見つけて除去します。培養液中の神経破片が増えると生存率が低下する可能性があるため、各DRGから神経破片を除去します。
氷上の円錐形のチューブに15ミリリットルのHBSSでDRGを集め、それらが底に落ち着くのを待ちます。ピペットを使用して、DRGからHBSSの大部分を吸引し、組織の損失を防ぐために、チューブ内に約100マイクロリットルの液体を残します。1ミリリットルのHBSSで3回洗浄し、5ミリリットルの以前に解凍した作業用STEMxyme溶液を組織に加えます。
蓋を透明なフィルムで覆い、チューブを横向きに37°Cの水浴に1時間浮かべます。酵素とのインキュベーション後、1ミリリットルの低オボムコイド阻害剤溶液をチューブに加える。P1000ピペットで細胞を10〜15回穏やかに粉砕し、組織の塊を落ち着かせます。
次に、解離した細胞を含む溶液の上部2〜3ミリリットルを新鮮な低オボムコイド溶液に移し、組織が完全に解離し、目に見える塊がなくなるまで繰り返します。チューブを室温で300 x gで10分間遠心分離します。ピペットを用いて上清を除去した後、先に実証したように、細胞ペレットを1ミリリットルのパンニングバッファーに再懸濁し、穏やかにピペットで混合する。
70マイクロメートルのセルストレーナーを1ミリリットルのパンニングバッファーで50ミリリットルのコニカルチューブで事前に濡らし、セルストレーナーを通して細胞溶液をろ過します。チューブを1ミリリットルのパンニングバッファーで洗浄し、ストレーナーに通します。セルの層状化のために、2ミリリットルの15%BSAを加え、閉じたチューブの側面を穏やかにコーティングします。
ミエリンの破片を除去するには、BSAクッションの上にあるチューブの側面にピペッティングして、細胞懸濁液を一度に1ミリリットルずつ慎重に重ねます。チューブを300 x gで室温で10分間遠心分離し、ゆっくりと加速および減速します。中央のミエリン層は白色物質のフレークを示す。
P1000ピペットを使用して、上部の透明な液体、その間のミエリン相、およびBSAを一度に1ミリリットルずつ除去し、ペレットを乱さないように約100マイクロリットルを残します。抗原賦活化のために、5ミリリットルのパンニングバッファーを加え、摂氏37度および10%二酸化炭素インキュベーターでチューブを30〜45分間インキュベートします。次に、インキュベートしたCD45皿をD-PBSで3回洗浄し、最後のすすぎを注ぎます。
次に、細胞懸濁液をCD45皿に注ぎます。ディッシュを室温で20分間インキュベートし、細胞が抗体に均等にアクセスできるように10分間隔で穏やかに旋回させます。CD45皿をそっと振って、斜めに支えます。
1ミリリットルの細胞懸濁液をディッシュ上で注意深くピペットで入れ、未結合の細胞を回収した。次に、それをD-PBSで3回洗浄したPDGFR-ベータ皿に移し、インキュベートします。前に示したように、結合していない細胞をPDGFR-βディッシュからO4ディッシュに移し、プレートをインキュベートします。
インキュベーション後、細胞懸濁液を15ミリリットルのコニカルチューブに移し、300 x gで10分間遠心分離します。細胞を所望の容量に再懸濁し、細胞生存率のためにトリパンブルーで1:1の比率に希釈します。血球計算盤を使用して、中型から大型の細胞を数えます。
ラミニンを除去し、プレートをインキュベートする前に細胞を乾燥させることなく、直ちに所望の密度で細胞をプレートします。固定、全体、およびイムノパンされたDRG培養物を、ニューロンについてはβ3-チューブリン、すべての核についてはDAPIで染色しました。DRG培養全体では約42.36%β3-チューブリン染色、イムノパンしたDRG培養物は約71.44%β3-チューブリン染色と判定され、イムノパンニングによる神経細胞の濃縮が有意に増加したことが明らかになりました。
組織を慎重に扱うことは非常に重要です。DRGを優しく扱い、余分な神経を整え、組織や培養物を興奮させたり失ったりしないように注意することはすべて、注意することが重要です。
