我々は、コメントと編集のヘルプは博士アランテスラーに感謝。この作品は、NIH NS062320によってサポートされていました。

1。セットアップ顕微鏡とイメージングの準備<ol><li>私たちのイメージングセットまでは、高速シャッターとMetamorphソフトウェアによって制御される冷却CCDカメラとライカMZ16蛍光実体顕微鏡で構成されています。 </li><li> ° C、動物の体温の間に、次の手術を維持するために、サーモスタット制御の加熱パッドを準備し、32.5に出力を調整します。 </li><li> 32.5℃まで手術中の脊髄の灌漑のための事前に暖かい滅菌リンゲル液または人工脳脊髄液（ACSF）。 </li><li>キシラジン（8 mg / kgの）とケタミン（120 mg / kg）のカクテルの腹腔内注射で動物を麻酔。 </li><li>小動物のバリカンで背中を剃ると綿棒で剃毛面積以上の脱毛ローションの小さなドロップを広げる。分後、70％エタノールに浸したガーゼのスポンジを使用して適用ローションを削除します。 </li></ol> 2。椎弓切除およびL5背根の外科的露出<ol><li>温水（32.5 ° C）パッドの上に動物を配置し、70％エタノールに浸した綿棒で皮膚を消毒する。 </li><li>背中の皮膚に - 実体顕微鏡で明視野照明の下、正中切開（3センチ〜2）を実行。必要に応じて、出血を止めるために綿棒を使用してください。 </li><li>基本的な腰椎を公開するために脊髄の筋肉組織を反映している。 </li><li>右両面半椎弓切除は、小さなrongeursを使用してL3 - S1脊髄セグメントを公開。腰仙骨脊髄の4-6セグメントを露出部分椎弓切除は、L2椎骨（2吻方腰の腸骨稜のレベル（L5 DRGの位置）でL5椎の右側の背の部分を削除して作成され最後の肋骨の椎尾）。暖かい滅菌リンゲル液で空洞を灌流。 </li><li>脊柱をフラット化するサポートクッション（圧延コットンガーゼ）に動物を配置します。露出面積を広くするために撤回のフックを使用してください。 </li><li>この時点で（麻酔の最初のIP注射、サプリメント（0.5X）後約30分、動物は完全に麻酔を維持するために皮下注射する必要があります。代わりに、ガス麻酔（2から4パーセント0.5L/min酸素のイソフルラン）1時間以上の撮像セッション中に繰り返し麻酔のために使用することができます。 </li></ol> 3。根切断術/後根粉砕<ol><li> YFP標識された（+）軸索を可視化する蛍光励起に切り替えます。 </li><li>サブQ（26ga.）針の先端を使用して、L5後根（DR）を覆う硬膜に小切開を行います。リンゲル液で繰り返し灌流と綿棒で軽く清掃。 </li><li>押しつぶされるようにサイトを識別し、微細な鉗子（デュモン＃5）subdurallyの片側を挿入する。 </li><li> 10秒間L5ルートの内側部を保持し、慎重に、しっかりと鉗子を閉じて、静かにピンセットを離します。 </li><li>生理的溶液で繰り返し洗浄し、綿棒で軽く清掃。 </li></ol> 4。画像取得と術後の手続き<ol><li>前と右の両方が低いと高倍率でのクラッシュ後のクラッシュのサイトとDREZを含む全体の露出した領域の複数の画像を取得します。 </li><li>画像は、単一のスナップショットとして、または30分以内に取得した10から20フレームの複数のストリームのいずれかとして取得される - 40ミリ秒の露光時間に。合焦画像は選択され、概要モンタージュは、後でPhotoshopを使用して作成されます。 </li><li>瘢痕形成を最小限に抑えるために、しっかりと露出脊髄の上に、人工硬膜に続く細い合成マトリックス膜（Biobrane）の一部を、適用する。彼らは脊髄に付着しているように、露出した脊髄のウィンドウに正確に合うようにピースをカットしてください。 </li><li>無菌5から0縫合糸で筋肉を閉じ、創傷クリップで正中切開を閉じてください。 </li><li>リンゲル液（0.3〜0.5 mLを皮下）注入、および皮下術後鎮痛（0.05 mg / kg）を2日間12時間ごとにブプレノルフィンを投与する。 </li><li>回復するまで加熱パッド（34 ° -35 ° C）に動物を保管してください。 </li></ol> 5。繰り返しイメージング<ol><li>動物を麻酔し、傷のクリップおよび縫合糸を除去。 </li><li>人工硬膜と薄い合成マトリックスの膜のパッチを削除し、後で再利用するためにリンゲル液を含有する滅菌チューブに保管してください。 </li><li>ゆっくりとサブQ針と細かい鉗子の曲がった先端で、蓄積されたすべての結合組織の瘢痕を削除します。暖かいリンゲル液で頻繁に灌流。 </li><li>クラッシュのサイトとDREZ含め、術野を再公開する、以前のセッションで結像されるYFP +軸索を再配置、および第4節で説明した手順を繰り返します。 </li></ol> 6。代表的な結果： 我々は、彼らが切除傷害後の再生成していないのに対し、ほとんどすべてのYFP +軸索は、のサイトを通じて成長、ことを観察したクラッシュ後の3日間による傷害（図1）11。通常、クラッシュ後の次の日、我々は、近位断端軸索と軸索を適切に破損していることが確認さ粉砕、（; 3日目と5例、図1）の遠位同じ軸索の断片化/変性の死にバック変性を認め。いくつかの追加の基準が明確に脇に置いていたまたは負傷から回復していた軸索から再生軸索を区別するために適用されます。これらは以下のとおり（1）再生軸索は、クラッシュのサイトを補充蛍光細胞質に起因する未標識のギャップの狭小化とは対照的に近位と遠位部変性（による挫滅サイトでYFPの非蛍光部分+軸索の展開内容を見る軸索が損傷を）生き残った場合、（2）再生軸索は、あまり明るい蛍光、および傷害を生き残った軸索よりも起伏の非常に薄いです、（3）再生神経突起は薄くなり、軸索の変性蛍光フラグメントよりも薄暗い蛍光灯されるときに通過する（4）存続するか脇に置いて軸索とは対照的に、再生軸索はDREZで停止する;彼らが延長し、（5）対照的に存続または免れる軸索に、再生軸索は絞輪のノードを示していない。図1は、4つの表面的なYFP +直後にクラッシュ後の軸索（;色の矢印A1）を示しています。クラッシュの3日後、すべての4つの軸索は、クラッシュのサイトを通じて成長する（A2）、単一の神経突起を拡張。クラッシュ後の5日は、神経突起が安定していると、これらまたはその他の近位軸索（A3）からの追加の成長はありません。 クラッシュ（約3mm / 2日間）11日以降4日間として変性した軸索（すなわち、神経内膜の管）のはるかに厚いと明るい蛍光フラグメントを通して細長いクラッシュサイトを越え、そして早期にDREZに到着した再生神経突起。これらの軸索とその先端の繰り返しイメージングは​​、2週間以上（図2）に対しては2〜3日間は、彼らが前方に成長したり撤回していなかったことが判明、しかし不動のまま。唯一の顕著な変化は、いくつかの軸索の先端とシャフトの腫れていた。これらの観​​察は、それゆえDREZで再生軸索の驚くほど迅速かつ慢性的な固定化を示しています。 <img src="/files/ftp_upload/3126/3126fig1.jpg" alt="図1"/> 図1：5日間以上後根の粉砕のサイトでL5 DR YFP +軸索の繰り返しイメージング。 L5ルートの内側部は押しつぶさ（赤矢印）と0日目、3、、ときめき後の5上に結像された。クラッシュの面積は、右側のパネル（A1 - A3）で拡大されます。 <img src="/files/ftp_upload/3126/3126fig2.jpg" alt="図2"/> 図2：軸索の繰り返しイメージングがL5ルートのクラッシュ後の20日間DREZに到着した4日目 、三軸索（色付きの矢印は）DREZに到着した。これらの軸索の先端は、同じ場所に残り、7日、9、13、15、および20日に、その後のイメージングセッションで同じような外観を持っている。他の軸索のヒントやランドマーク（アスタリスク）に対して相対的軸索の先端の位置は、撮像セッションの間に軸索を運動性を決定するために使用された。

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	<li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Watching+the+neuromuscular+junction.">Watching the neuromuscular junction.</a> J Neurocytol. 32, 767-775 (2003).</li><li>Bishop, D. L., Misgeld, T., Walsh, M. K., Gan, W. B., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+branch+removal+at+developing+synapses+by+axosome+shedding.">Axon branch removal at developing synapses by axosome shedding.</a> Neuron. 44, 651-661 (2004).</li><li>Balice-Gordon, R. J., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+visualization+of+the+growth+of+pre-+and+postsynaptic+elements+of+neuromuscular+junctions+in+the+mouse.">in vivo visualization of the growth of pre- and postsynaptic elements of neuromuscular junctions in the mouse.</a> J Neurosci. 10, 894-908 (1990).</li><li>Trachtenberg, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex.">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420, 788-794 (2002).</li><li>Pan, F., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+dendritic+spine+development+in+the+mouse+cortex.">Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex.</a> Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).</li><li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain.">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3, 489-496 (2006).</li><li>Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+imaging+of+axonal+degeneration+and+regeneration+in+the+injured+spinal+cord.">in vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord.</a> Nat Med. 11, 572-577 (2005).</li><li>Misgeld, T., Nikic, I., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+imaging+of+single+axons+in+the+mouse+spinal+cord.">in vivo imaging of single axons in the mouse spinal cord.</a> Nat Protoc. 2, 263-268 (2007).</li><li>Davalos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+in+vivo+imaging+of+densely+populated+glia,+axons+and+blood+vessels+in+the+mouse+spinal+cord+using+two-photon+microscopy.">Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy.</a> J Neurosci Methods. 169, 1-7 (2008).</li><li>Maio, D. D. i. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+imaging+of+dorsal+root+regeneration:+Rapid+immobilization+and+presynaptic+differentiation+at+the+CNS/PNS+border.">in vivo imaging of dorsal root regeneration: Rapid immobilization and presynaptic differentiation at the CNS/PNS border.</a> Journal of Neuroscience. 31, 4569-4582 (2011).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

それはその後のイメージングセッションで複数の手術侵襲と麻酔薬の手続きが続く広範囲に軸索の成長を監視するためにかなりの背側椎弓切除を必要とするため、直接生きているマウスのイメージングDR再生は特に困難である。いくつかの戦略は、これらの課題を克服する助け。最初に、成功したイメージングは​​、麻酔や出血の持続期間を最小限に抑えることにより、マウスの死亡率を?...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td> HラインTHY1 - YFP（2-4ヶ月齢、雌雄） </td><td>ジャクソン研究所（バーハーバー、ME） </td><td> 003782 </td><td></td></tr><tr><td>キシラジン（AnaSed注射、滅菌溶液） </td><td>ロイド研究所、（シェナンドア、LA） </td><td> 4811 </td><td> 8 mg / kgを</td></tr><tr><td>ケタミン（塩酸ケタミン注射、USP） </td><td>ホスピーラ社（レイクフォレスト、イリノイ州） </td><td> 2051 </td><td> 120 mg / kgの</td></tr><tr><td>ブプレノルフィン（注射Buprenex）（0.05 mg / kg体重） </td><td>レキットベンキーザーティカルズ社（リッチモンド、バージニア州） </td><td> 7571 </td><td></td></tr><tr><td>小動物のバリカン</td><td>オスタープロフェッショナル、（マックミンヴィル、テネシー州） </td><td> 76059-030 </td><td></td></tr><tr><td>脱毛ローション</td><td>教会＆ドワイト共同（プリンストン、ニュージャージー州） </td><td>ベビーオイルとNairさん</td><td></td></tr><tr><td>ガーゼのスポンジ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック、（ピッツバーグ、ペンシルバニア州） </td><td> 22-362-173 </td><td></td></tr><tr><td>綿棒</td><td>フィッシャーサイエンティフィック、（ピッツバーグ、ペンシルバニア州） </td><td> 14から960 - 3Q </td><td></td></tr><tr><td> 1 mLのシリンジ</td><td>ベクトン、ディクソンと会社フランクリンレイクス、ニュージャージー州） </td><td> 309602 </td><td></td></tr><tr><td>皮下（サブQ）針、26ga。 </td><td>ベクトン、ディクソンと会社（フランクリンレイクス、ニュージャージー州） </td><td> 305115 </td><td></td></tr><tr><td>春のはさみや鉗子</td><td>ファイン科学ツール、（フォスターシティ、カリフォルニア州） </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2.5 mmの湾曲したrongeurs </td><td>ファイン科学ツール、（フォスターシティ、カリフォルニア州） </td><td> 16221〜14 </td><td></td></tr><tr><td>乳酸加リンガー液USP </td><td> B. Braunはメディカル株式会社、（アーバイン、カリフォルニア州） </td><td> BBR - L7502 </td><td></td></tr><tr><td>滅菌生理食塩水</td><td> APPファーマシューティカル（シャンバーグ、イリノイ州） </td><td> 918610 </td><td></td></tr><tr><td>薄い合成マトリックス膜（Biobrane） </td><td> Bertek医薬品、（ウェストバージニア州モーガンタウン） </td><td> 62794-096-251 </td><td></td></tr><tr><td>人工硬膜</td><td>ゴアは、MVPデュラエースの代替、WLゴア＆アソシエイツ、（フラッグスタッフ、アリゾナ州）を排除してください</td><td> 1MVP40 </td><td></td></tr><tr><td> 5から0絹縫合糸</td><td>エチコン社（サマービル、ニュージャージー州） </td><td> K - 580 </td><td></td></tr><tr><td>創傷クリップ</td><td>パーフェクト - ETSブリュノ、（Burnea、フランス） </td><td> A75 </td><td></td></tr><tr><td>蛍光実体顕微鏡</td><td>ライカマイクロシステムズ、（ヴェッツラー、ドイツ） </td><td> MZ16 </td><td></td></tr><tr><td> CCDカメラ</td><td>浜松、（ブリッジウォーター、ニュージャージー州） </td><td> ORCA - Rx2の</td><td></td></tr><tr><td>温度コントローラ</td><td>世界精密機器（サラソタ、フロリダ州） </td><td> ATC 1000年</td><td></td></tr><tr><td> Metamorphソフトウェア</td><td> Molecular Devices社、（サニーベール、カリフォルニア州） </td><td></td><td></td></tr><tr><td>フォトショップ</td><td>アドビシステムズ、サンノゼ、カリフォルニア州</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

live imaging of dorsal root axons after rhizotomy

脊髄神経根の損傷によって負傷した一次感覚軸索は、慢性的な痛みや永続的な感覚消失につながる、脊髄に再生に失敗する。脊髄への後根（DR）軸索の再生が後根エントリゾーン（DREZ）、CNSとPNSの間の界面で阻止される。神経損傷に関連する複雑な変更は事後解析から推定されているためDREZで再生を防止する分子や細胞のイベントの我々の理解は、部分的に、不完全です。このような軸索再生のようなダイナミックな細胞プロセスは、、最高の各生きている動物の複数の観測値とのリアルタイムイベントをキャプチャするテクニックを研究しています。 生体内で連続的にニューロンを監視するために我々の能力は、光学系およびマウス遺伝子組換えの革新的な技術革新に起因し飛躍的に増加している。 THY1 - GFPトランスジェニックマウスの数行は、神経細胞のサブセットを遺伝的に異なる蛍光色でラベル付けされている、個々の神経細胞がインビボ 1 で撮像される許可。これらのマウスは、筋肉の2-4と5月7日脳のin vivoイメージングのために広く使用されており、静的解析が解決していないことを生理学的メカニズムに新たな洞察を提供している。生きている脊髄の神経細胞のイメージング研究では、ごく最近になって始めている。リヒトマンと彼の同僚は、最初のワイド視野顕微鏡8,9で負傷した脊柱（DC）軸索を追跡することによって、その実現可能性を示した。深くに位置するDCの軸索のin vivoイメージング多光子、ミクログリアと血管はまた10を達成している。過去数年間、我々は広視野顕微鏡とTHY1 - YFPマウスのHのラインを使用してDRの軸索の再生を監視するためのin vivoイメージングに適用することに先駆けて。これらの研究は、DRの軸索は、脊髄11内に再生成が禁止されている理由についての小説仮説に私たちを導いた。 THY1 - YFPマウスのHラインでは、別個のYFP +軸索は、表面的にいくつかの軸索を同時に監視できるようになる、配置されている。我々はDREZに到着DRの軸索がより頸髄よりも腰椎でイメージングされたことを知りました。本報告では、我々は再生成DRの軸索の成功を長期的かつ繰り返しイメージングを確保するために有用な発見したいくつかの戦略を説明します。これらは、繰り返し挿管と呼吸の中断をなくす手術に伴うストレスや瘢痕形成を最小限にし、光毒性なしに高分解能で安定した画像を取り込む方法が挙げられる。

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Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

アン<em&gt; in vivoで</em後根の粉砕は、次の一次感覚軸索を監視する&gt;イメージングプロトコルが記述されています。手順は、広視野蛍光顕微鏡とTHY1 - YFPトランスジェニックマウスを利用し、CNSのインタフェースを持つPNSと軸索の相互作用が4cm以上の軸索再生の繰り返しイメージングを可能にする。

根切断術後の後根の軸索のライブイメージング

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

live-imaging-of-dorsal-root-axons-after-rhizotomy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.7K ビュー.  Shriners Hospitals Pediatric Research Center and Department of Anatomy and Cell Biology. アン in vivoでイメージングプロトコルが記述されています。手順は、広視野蛍光顕微鏡とTHY1 - YFPトランスジェニックマウスを利用し、CNSのインタフェースを持つPNSと軸索の相互作用が4cm以上の軸索再生の繰り返しイメージングを可能にする。

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Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after injury (Teng et al., 2006). It is recognized that transcriptional programs essential for neurite and axonal outgrowth are 
reactivated upon injury in the PNS (Makwana et al., 2005). However the tools available to analyze neuronal gene regulation in vivo are limited and 
often challenging.
The dorsal root ganglia (DRG) offer an excellent injury model system because both the CNS and PNS are innervated by a 
bifurcated axon originating from the same soma. The ganglia represent a discrete collection of cell bodies where all transcriptional events occur, 
and thus provide a clearly defined region of transcriptional activity that can be easily and reproducibly removed from the animal. Injury of nerve 
fibers in the PNS (e.g. sciatic nerve), where axonal regeneration does occur, should reveal a set of transcriptional programs that are distinct from 
those responding to a similar injury in the CNS, where regeneration does not take place (e.g. spinal cord). Sites for transcription factor binding, 
histone and DNA modification resulting from injury to either PNS or CNS can be characterized using chromatin immunoprecipitation (ChIP). 
Here, we describe a ChIP protocol using fixed mouse DRG tissue following axonal injury. This powerful combination provides a means for characterizing the pro-regeneration chromatin environment necessary for promoting axonal regeneration.

We present a method for chromatin immunoprecipitation from dorsal root ganglia tissue following axonal injury. The approach can be used to identify specific transcription factor binding sites and epigenetic modification of histone and DNA important for the regeneration of injured axons in both the peripheral and central nervous system.

軸索損傷後の脊髄後根神経節の組織からのクロマチン免疫沈降

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

神経科学

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

培養大人の背根神経節ニューロンの軸索再生の遺伝学的研究

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) is an important mechanism for neuromodulation by acetylcholine (ACh). The difficulty with access to probing the signaling mechanisms within intact axons and at nerve terminals both in vitro and in vivo has limited progress in the study of the pre-synaptic components of synaptic plasticity. Here we introduce a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal (vHipp)&#8211;accumbens (nAcc) circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze both the pre- and post-synaptic components of transmission while selectively varying the genetic profile of the pre- vs post-synaptic neurons. We demonstrate that projections from vHipp microslices, as pre-synaptic axonal input, form multiple, reliable glutamatergic synapses with post-synaptic targets, the dispersed neurons from nAcc. The pre-synaptic localization of various subtypes of nAChRs are detected and the pre-synaptic nicotinic signaling mediated synaptic transmission are monitored by concurrent electrophysiological recording and live cell imaging. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of glutamatergic synaptic plasticity in vitro.

We developed a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal &#8211; accumbens circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze presynaptic mechanisms of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediated synaptic transmission. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of synaptic plasticity.

ニコチン誘導性カルシウムシグナリングおよび腹側海馬軸索に沿って神経伝達物質放出のライブイメージング

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These neurotropic cancer cells have a unique ability to migrate unidirectionally along nerves towards the central nervous system (CNS). The dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model is a three dimensional (3D) in vitro model frequently used for studying the interaction between neural stroma and cancer cells. In this model, mouse or human cancer cell lines are grown in ECM adjacent to preparations of freshly dissociated cultured DRG. In this article, the DRG isolation protocol from mice, and implantation in petri dishes for co-culturing with pancreatic cancer cells are demonstrated. Five days after implantation, the cancer cells made contact with the DRG neurites. Later, these cells formed bridgeheads to facilitate more extensive polarized, neurotropic migration of cancer cells.

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

This video article shows the use of the dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model in pancreatic ductal adenocarcinoma.

後根神経節モデル：癌性神経浸潤のin vitroモデルでは

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.

This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

後根神経節インジェクションおよび後根感覚軸索再生のためのモデルとして傷害をつぶします

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral tissues, such as skin, muscle and visceral organs, as well as the spinal dorsal horn of the central nervous system. Sensory neurons transmit somatic sensation, including touch, pain, thermal, and proprioceptive sensations. Therefore, DRG primary cultures are widely used to study the cellular mechanisms of nociception, physiological functions of sensory neurons, and neural development. The cultured neurons can be applied in studies involving electrophysiology, signal transduction, neurotransmitter release, or calcium imaging. With DRG primary cultures, scientists may culture dissociated DRG neurons to monitor biochemical changes in single or multiple cells, overcoming many of the limitations associated with in vivo experiments. Compared to commercially available DRG-hybridoma cell lines or immortalized DRG neuronal cell lines, the composition and properties of the primary cells are much more similar to sensory neurons in tissue. However, due to the limited number of cultured DRG primary cells that can be isolated from a single animal, it is difficult to perform high-throughput screens for drug targeting studies. In the current article, procedures for DRG collection and culture are described. In addition, we demonstrate the treatment of cultured DRG cells with an agonist of neuropeptide FF receptor type 2 (NPFFR2) to induce the release of peptide neurotransmitters (calcitonin gene-related peptide (CRGP) and substance P (SP)).

Dorsal root ganglia (DRG) primary cultures are frequently used to study physiological functions or pathology-related events in sensory neurons. Here, we demonstrate the use of lumbar DRG cultures to detect the release of neurotransmitters after neuropeptide FF receptor type 2 stimulation with a selective agonist.

伝達物質の放出を勉強する後根神経節細胞の分離と培養

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its highly-organized subcellular architecture, we recently developed a new imaging modality, named spectral reflectometry (SpeRe), which enables unprecedented label-free nanoscale imaging of the live myelinated axons in situ. The underlying principle is to obtain nanostructural information by analyzing the reflectance spectrum of the multilayered subcellular structure. In this article, we describe a detailed step-by-step protocol for performing a basic SpeRe imaging of the nervous tissues using a commercial confocal microscopic system, equipped with a white-light laser and a tunable filter. We cover the procedures of sample preparation, acquisition of spectral data, and image processing for obtaining nanostructural information.

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

Here, we present a step-by-step protocol for imaging myelinated axons in a fixed brain slice using a label-free nanoscale imaging technique based on spectral reflectometry.

その場で有髄軸索のスペクトル反射型顕微鏡

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after peripheral nerve injury. Peripheral monocytic cells, including macrophages, are known to respond to a tissue injury through phagocytosis, antigen presentation, and cytokine release. Emerging evidence has implicated the contribution of dorsal root ganglia macrophages to neuropathic pain development and axonal repair in the context of nerve injury. Rapidly phenotyping (or &#8220;rapid isolation of&#8221;) the response of dorsal root ganglia macrophages in the context of nerve injury is desired to identify the unknown neuroimmune factors. Here we demonstrate how our lab rapidly and effectively isolates macrophages from the dorsal root ganglia using an enzyme-free mechanical dissociation protocol. The samples are kept on ice throughout to limit cellular stress. This protocol is far less time consuming compared to the standard enzymatic protocol and has been routinely used for our Fluorescence-activated Cell Sorting analysis.

Here we present a mechanical dissociation protocol to rapidly isolate macrophages from the dorsal root ganglion for phenotyping and functional analysis.

ドーサルルート神経節マクロファージの迅速な分離

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells

The process of myelination is essential to enable rapid and sufficient signal transduction in the nervous system. In the peripheral nervous system, neurons and Schwann cells engage in a complex interaction to control the myelination of axons. Disturbances of this interaction and breakdown of the myelin sheath are hallmarks of inflammatory neuropathies and occur secondarily in neurodegenerative disorders. Here, we present a coculture model of dorsal root ganglion explants and Schwann cells, which develops a robust myelination of peripheral axons to investigate the process of myelination in the peripheral nervous system, study axon-Schwann cell interactions, and evaluate the potential effects of therapeutic agents on each cell type separately. Methodologically, dorsal root ganglions of embryonic rats (E13.5) were harvested, dissociated from their surrounding tissue, and cultured as whole explants for 3 days. Schwann cells were isolated from 3-week-old adult rats, and sciatic nerves were enzymatically digested. The resulting Schwann cells were purified by magnetic-activated cell sorting and cultured under neuregulin and forskolin-enriched conditions. After 3 days of dorsal root ganglion explant culture, 30,000 Schwann cells were added to one dorsal root ganglion explant in a medium containing ascorbic acid. The first signs of myelination were detected on day 10 of coculture, through scattered signals for myelin basic protein in immunocytochemical staining. From day 14 onward, myelin sheaths were formed and propagated along the axons. Myelination can be quantified by myelin basic protein staining as a ratio of the myelination area and axon area, to account for the differences in axonal density. This model provides experimental opportunities to study various aspects of peripheral myelination in vitro, which is crucial for understanding the pathology of and possible treatment opportunities for demyelination and neurodegeneration in inflammatory and neurodegenerative diseases of the peripheral nervous system.

In the coculture system of dorsal root ganglia and Schwann cells, myelination of the peripheral nervous system can be studied. This model provides experimental opportunities to observe and quantify peripheral myelination and to study the effects of compounds of interest on the myelin sheath.

ラット背根神経節外植片とシュワン細胞の共培養における末梢軸索のin vitro髄鞘形成

The process of myelination is essential to enable rapid and sufficient signal transduction in the nervous system. In the peripheral nervous system, ...

Enrichment of Adult Mouse Dorsal Root Ganglia Neuron Cultures by Immunopanning

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as well as various other cell types. Published culture protocols often refer to whole dissociated DRG cultures as being neuronal, despite the presence of fibroblasts, Schwann cells, macrophages, and lymphocytes. While these whole DRG cultures are sufficient for imaging applications where neurons can be discerned based on morphology or staining, protein or RNA homogenates collected from these cultures are not primarily neuronal in origin. Here, we describe an immunopanning sequence for cultured mouse DRGs. The goal of this method is to enrich DRG cultures for neurons by removing other cell types. Immunopanning refers to a method of removing cell types by adhering antibodies to cell culture dishes. Using these dishes, we can negatively select against and reduce the number of fibroblasts, immune cells, and Schwann cells in culture. This method allows us to increase the percentage of neurons in cultures.

This paper describes an immunopanning protocol for adult mouse dorsal root ganglia. By adhering antibodies to culture plates, we can negatively select and remove non-neuronal cells. We show that the cultures are enriched for neurons using this protocol, allowing for an in-depth study of neuronal responses to manipulation.

イムノパンニングによる成体マウス背根神経節培養の濃縮

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as ...