新たな証拠は、神経損傷の文脈における神経因性疼痛の発達および軸索修復への後根神経節マクロファージの寄与に関与している。急速に、未知の神経免疫因子を同定するために、後根神経節マクロファージの応答を迅速にフェノノタイピングすることが望まれる。ここでは、酵素を含まない機械的解離プロトコルを使用して、我々の研究室がドーサル根神経節からマクロファージを迅速かつ効果的に分離する方法を示す。
このプロトコルは、標準的な酵素プロトコルに比べてはるかに時間がかかり、蛍光活性化細胞選別分析に日常的に使用してきました。実験を開始する前に、9個の培地を1体積のカルシウムとマグネシウムフリーの10X HBSSと混合して、密度勾配媒体の働く溶液を調製し、氷の上に保管します。後足ピンチに対する応答の欠如によってマウスが完全に麻酔されていることを確認します。
テープで固定された4本の足で、薬液のヒュームフードの中に麻酔をかけられたマウスを置くことから始めます。鉗子を使用して、胸部の下の皮膚を持ち上げます。そして、手術用はさみで、肝臓と横隔膜を露出させるために小さな切開を行います。
同じはさみを使用して、横隔膜と胸部を切ります。そして、胸膜腔を開いて鼓動心臓を露出する。次に虹彩はさみで、すぐに右心房の付属物をカットします。
出血が指摘されたら、左心室の後部端に30ゲージの針を挿入し、ゆっくりと動物を浸透させるために10ミリリットルの予冷1X PBSを注入する。足切り切れ切れ術を行うために、マウスを起こしやすい位置に置きます。大きさ11メスを使用して、胸部領域から仙骨領域まで2つの縦方向深部深切開を行います。
次に、後筋層を露出する皮膚を除去する。その後、フリードマン・ピアソン・ロンガーで、腰仙骨脊椎プロセスと両側横方向のプロセスが暴露されるまで、結合組織および筋肉を剥がす。まず、フリードマン・ピアソンの回転器を使用して背骨の柱を慎重に開き、フリードマン・ピアソン・ロンガーとノイエスのスプリングハサミを切り替えて椎骨を取り除き、脊髄を無傷の脊髄を露出させます。
慎重にイプシテララルと逆角腰神経DRGを解剖.Dounce組織ホモジナイザーで氷冷カルシウムとマグネシウムフリーの1X HBSSの1ミリリットルに入れる。DounceホモジナイザーのDRG組織を緩い害虫で20〜25回均質化する。
滅菌50ミリリットルの円錐管に無菌70マイクロメートルのナイロンセルストレーナーを入れる。800マイクロリットルの氷コード1X HBSSを使用して、細胞ストレーナーを濡らします。ホモジナイザーから均質化した組織懸濁液を湿った細胞のストレーナーに集め、50ミリリットルの円錐管に集めるピペットを使用する。
ホモジナイザーを800マイクロリットルの氷冷1X HBSSで2回リンスし、液体を同じ50ミリリットル円錐形チューブに集めて収量を増やします。平衡した氷冷同位密度勾配媒体の1.5ミリリットルを無菌5ミリリットルポリスチレンフラスコチューブに加えます。50ミリリットルの円錐管からこのフラスコチューブにホモネート細胞を移します。
そして、よく混ぜるために上下にピペット。さらに500マイクロリットルの1X HBSSを追加して上部を密封します。800倍Gで細胞を摂氏4度で20分間遠心分離する。
チューブの底部の細胞ペレットを邪魔することなく、ミエリンを含む上清を慎重に培地に吸引する。5%のウシ胎児血清を含むPBSの100マイクロリットルをペレットに加え、DRG細胞を再中断する。次に、アルファマウスCX3CR1 APC抗体を細胞に加え、摂氏4度で暗闇の中で1時間インキュベートします。
5ミリリットルのPBSで細胞を1回洗います。セルを摂氏4度で8分間Gの360倍に遠心分離する。上清を吸引し、その後、細胞ペレットを300マイクロリットルのPBSで再懸濁して事実分析を行う。
マクロファージを枯渇させるためにFK結合タンパク質二量体APをMaFIAマウスに腹腔内注射した後、AP処理マウスのDRGにおけるGFP陽性細胞の有意な損失があった。事実分析は、AP処理マウスにおけるGFP高集団の枯渇に成功したことを明らかにし、単離された細胞の高品質を実証した。処置動物のDRGから全単離細胞の4%がGFP高マクロファージであった。
対照的に、全DRG細胞のわずか0.4%が、AP処理マウスにおいてGFP高マクロファージであった。野生型マウスから機械的に単離されたDRG細胞を、ΑマウスCX3CR1-APC抗体で染色した。DRG細胞の6%はCX3CR1陽性マクロファージであった。
細胞生存率をヨウ化プロピジウムで評価した際、80%以上の新たに単離されたDRG細胞が生存可能であることが明らかになった。不満足な細胞収量が指摘された場合、DRG組織の不十分または過剰な均質化が疑われる可能性がある。また、DRG解剖は初心者のために繰り返し練習を必要とするかもしれません。
おそらく、私たちのプロトコルの適用は、衛星細胞やT細胞などの他の非神経細胞を研究するために拡大することができます。さらなる研究は、細胞単離の有効性を確認するために必要とすることができる。
