食道扁平上皮癌、ESCCは致命的であり、世界中で蔓延しています。3次元オルガノイドは、ESCCの厳しい負担と戦うための分野の進歩を加速するために利用することができます。4NQOで処理したマウスのシングルセル由来3Dオルガノイドは、ESCCの開始と発生に伴う分子変化の機能的アノテーションのために、容易かつ安価に操作することができます。
このモデルは、変異原誘発腫瘍の遺伝的不均一性を捉えています。したがって、これらのオルガノイドは、新しい治療戦略をテストしたり、腫瘍形成を促進する顕著な遺伝的変化を特定したりするための生理学的に関連するプラットフォームを提供します。動物の解剖と臓器採取のデモンストレーションを手伝うのはスタッフアソシエイトの冨田康人であり、パラフィン包埋手順のためのオルガノイドの準備を実演するのは私の研究室のポスドク研究員である松浦典弘です。
まず、中腹部の毛皮をつまんで外科用ハサミを使用して安楽死させたマウスの皮膚を開き、下腹部からあごまで頭蓋尾の腹側正中線切開を行います。正中線切開から始めて、マウスの両側の手足まで伸びる放射状の切り込みを入れ、皮膚フラップを膨らませて開きます。解剖ハサミを使用して頸管気管を露出させるには、正中線で唾液腺を分割します。
胸部気管を露出させるには、胸骨を取り除きます。鉗子で腹膜をそっとつまんで持ち上げ、ハサミを使って腹膜を頭蓋尾側に分割します。胸郭に沿って横方向に。
横隔膜の尾面から肝臓を静かに引っ込め、はさみを使用して、胸骨の切り欠き、特に剣状突起の背側表面で横隔膜を小さく切開します。胸郭が胸部内容物から分離したら、横隔膜の切開部にハサミを挿入し、胸骨の背側に密着している頸帯を頭蓋的に解剖して、下の臓器への損傷を防ぎます。ハサミを使用して胸骨の両側の肋骨を切り、胸骨を取り除きます。
腹部食道を露出させるには、鉗子で前庭を持って胃を前方にそっと持ち上げます。ハサミを使用して、胃と食道から脾臓、膵臓、腸間膜を解剖します。胸部食道を露出させるには、気管を甲状腺軟骨まですぐにそっと持ち上げ、虹彩ハサミを使用して気管の背側の食道を解剖します。
甲状腺軟骨の気管を虹彩ハサミで分割します。気管を尾方向に慎重に解剖して、食道の残りの部分から引き剥がします。肺、心臓、胸腺を気管と一緒に完全に取り除きます。
幽門の胃をハサミで分けます。鉗子で前庭を保持し、頭蓋骨を解剖することによって食道を椎骨から分離します。食道を甲状腺軟骨のレベルで分割し、食道と胃を完全に収穫します。
噴門で食道を分割して胃と食道を分離し、食道の外面の筋膜を解剖します。組織学用のサンプルを予約するには、ハサミで縦方向に分割します。残りの無傷の食道と冷たいPBSを氷の上に置きます。
より大きな湾曲に沿って胃を開き、PBSで十分に洗います。前胃を分離し、冷たいPBSで洗います。舌を収穫するには、ピン留めされた針を鼻から外し、ピンセットで舌を引き抜きます。
舌をできるだけ長く切り、氷の上の冷たいPBSに入れます。解離した組織を培養皿に移した後、鉗子を使用して上皮から筋肉層を慎重に取り除きます。上皮を500マイクロリットルの0.25%トリプシンを含む微小遠心チューブに移し、サーモミキサーで摂氏37度、800rpmで10分間インキュベートします。
短時間遠心分離した後、50ミリリットルの円錐管に保持した100マイクロメートルのセルストレーナーに細胞懸濁液を円運動で移し、次に3ミリリットルの大豆トリプシンインヒビター(STI)を円運動でストレーナーに通して洗浄し、1ミリリットルのツベルクリンシリンジプランジャーのベースでストレーナーをこすり、細胞を押し込みます。ストレーナーを3ミリリットルのPBSで3〜5回洗浄し、洗浄の合間にシリンジのベースでストレーナーをこすります。遠心分離によって細胞をペレット化した後、再懸濁のためにチューブに1ミリリットルの溶液を残して上清を除去します。
ペレットが再懸濁されたら、細胞懸濁液を70マイクロメートルのセルストレーナーを通して新しい50ミリリットルの円錐管に移します。チューブを再度遠心分離した後、ペレットを100マイクロリットルのマウスオルガノイド培地(MOM)に再懸濁し、自動細胞カウントを実行します。プレート5, 000の生細胞を75%基底膜抽出物、またはBME、およびMOMに1ウェルあたり50マイクロリットルの総容量で。
200マイクロリットルのワイドボアチップを使用して、チップとウェルの底部または側面との接触を避けて、各ウェルの中央に50マイクロリットルの液滴をゆっくりと追加します。BMEを摂氏37度のインキュベーター内で30分間固化させ、二酸化炭素を5%、相対湿度を95%にします。インキュベーション後、ウェルあたり500マイクロリットルのMOMを慎重に加えます。
3日目または4日目にMOMを交換し、その後2〜3日ごとに通過の準備ができるまで交換します。解凍したBMEを氷の上に置き、MOMを0.05%トリプシン、およびSTIを摂氏37度に予熱してから使用してください。ワイドボアマイクロピペットチップを使用して、上清と一緒にBMEドーム内のオルガノイドを収集し、上下にピペッティングしてBMEを破壊します。
短時間の遠心分離によってオルガノイドペレットを得た後、それが取り除かれたら、500マイクロリットルの0.05%トリプシンに再懸濁します。チューブをサーモミキサーで摂氏37度、800rpmで10分間インキュベートします。600マイクロリットルのSTIでトリプシンを不活性化します。
遠心分離して上清を廃棄した後、細胞ペレットを100マイクロリットルのMOMに再懸濁します。トリパンブルー除外による自動細胞カウントを実行します。オルガノイドを固定するには、ペレットを静かに取り除き、摂氏4度で一晩300マイクロリットルの4%パラホルムアルデヒドに再懸濁します。
次に、マイクロ遠心チューブラックを反転させ、その表面を天井フィルムのシートで覆い、対応するオルガノイドIDでラベル付けすることにより、埋め込み面を準備します。PBS洗浄したオルガノイドペレットで除去したパラホルムアルデヒドを、チューブの側面に50マイクロリットルの寒天を加えて慎重に重ねます。この手順を繰り返します。
ペレットを乱すことなく、寒天ゲル液滴中のペレットを包埋面の天井フィルムに移し、摂氏4度で45分間固化させる。鉗子を使用して、固化したオルガノイドペレットを含む液滴を標識された病理カセットに注意深く移します。正常なマウス食道舌および前胃オルガノイドを明視野イメージングおよび組織学的染色により形態学的に解析した。
4NQO治療マウスの食道扁平上皮癌は、核異型と突然の角質化を示しました。継代培養時のオルガノイド形成率を測定して評価したオルガノイドの自己複製能は、成熟オルガノイドの増殖性バサロイド細胞の減少を反映して時間関数として形成速度が低下することを示した。オルガノイドの成長速度論は、さまざまな時点での形態によって明らかにされています。
オルガノイドの内核の角質化は、10日目までに顕著になります。増殖性基底細胞は、14日目および21日目の時点でも、最も外側の細胞層に留まる。4NQO未処理マウスから作製した正常マウス舌オルガノイドの集団倍増曲線は、複数回の継代および長期培養で着実な成長を示しています。
オルガノイドは、新規治療標的を特定するためのハイスループットスクリーニング、特定の遺伝子機能を調べるためのCRISPRベースの編集、または腫瘍微小環境におけるどの相互作用が形質転換に影響を与えるかを定義するための共培養のためのプラットフォームです。この技術により、空気消化管扁平上皮癌の生物学における部分EMTやHPV感染などの現象や免疫系との相互作用を調べることができました。
