これらの方法は、免疫細胞介在性腫瘍細胞傷害性および侵襲的行動に対する3D設定における機械的な洞察を提供することができる。この技術の主な利点は、この3Dスフェロイド共培養モデルは、複数の後続のエッセイのためのスフェロイドの転送を必要としないことです。この手順をデモンストレーションすることは、私たちの部門の博士課程の学生であるアプスラ・ナシルです。
細胞培養フードで無菌技術を用いてスフェロイドを生成するには、500マイクロリットルの溶融アガロースを81マイクロウェルゴム型に加え、気泡を避けるように注意を払う。アガロースが慎重に固まった場合、12ウェルプレートの個々の井戸にアガロースキャストを飛び出すためにゴム型を曲げます。各ウェルに10%の牛血清を添加した細胞培養培地の2.5ミリリットルを各ウェルに加え、1時間細胞培養インキュベーターにプレートを入れる。
インキュベーションの終わりにプレートを傾けて、まず周囲の細胞培養培地を除去し、次に播種チャンバー内で、各細胞の播種室に滴下して腫瘍細胞懸濁液に調製した190マイクロリットルを慎重に播種する。細胞培養インキュベーターで15分間インキュベーターを加えた後、キャストの外側に培地2.5ミリリットルで添加し、プレートを48時間インキュベーターに戻します。T細胞共培養を設定するために、適切な数のT細胞を190マイクロリットルの不適切なT細胞培養で再懸濁し、12ウェルプレートまでウェル毎に培地を、アガロースキャストを取り巻く細胞培地を除去することを可能にした。
次に、播種室で、回転楕円体を取り除かずに、回転楕円体が吸引されたかどうかを確認し、P200に装填されたピペットを各キャストの約半センチメートル上に保持し、T細胞をスフェロイドを除去することなくドロップワイズの方法で慎重にキャストに播種します。すべてのキャストを播種すると、15分間プレートを細胞培養インキュベーターに戻してから、胎児ウシ血清を添加した新鮮な細胞培養培地を各キャストの外側にさらに48時間のインキュベーションを加えた。3D共培養物を1型糖尿病のコラーゲン希釈ストックコラーゲンに血清フリーベース培地を用いたコラーゲンを1ミリリットル当たり3ミリグラムの最終作業濃度に埋め込み、10X PBSの11マイクロリットルを加える場合は、100マイクロリットル当たり1.2マイクロリットルの水酸化ナトリウムを1.2マイクロリットル加える。
1時間氷上でコラーゲン溶液を中和した後、デモンストレーションしたように、周囲および各キャスト内の細胞培養培地を除去する。中和したコラーゲンを各キャストに慎重に加え、ドロップワイズで投げ、すぐにプレートを5分間培養インキュベーターに戻してから、インキュベーションでさらに1時間プレートを反転させた。インキュベーションの最後に、プレートを右側にバイオセーフティフードに置き、新鮮な細胞培養培地を各ウェルの側面にゆっくりと加えます。
その後、プレートを細胞培養インキュベーターに48時間戻す。埋め込まれた3D共培養の免疫蛍光染色のために、加湿チャンバ内の室温で一晩5.4%ホルマリンにスフェロイドを含むアガロースキャスト全体を固定する。翌日、アガロースキャストを取り巻くホルマリンを取り除き、洗練された先端ピンセットを使用して各コラーゲンマトリックスの角をつかみ、鋳物を単一の流体運動で播種チャンバーから剥離できるようにします。
各コラーゲンパッチを8つのウェルチャンバースライドの単一の井戸に入れ、各ウェルに0.5%オクトキシノールの250マイクロリットルを加えます。室温で1時間後にオクトキシノールを250マイクロリットルのブロッキング溶液に交換してください。室温で1時間後、各ウェルに目的の一次抗体カクテルの250マイクロリットルを追加し、室温で一晩暗い加湿チャンバーにスライドを置きます。
翌朝、各ウェルから一次抗体を取り除き、洗浄ごとに室温で5分間300マイクロリットルのIFバッファでウェルを3回洗浄します。最後の洗浄後、250マイクロリットルの不適切な二次抗体溶液を各ウェルに加え、光から保護された室温で1時間インキュベーションします。インキュベーションの終わりに抗体を取り除き、示されるようにIFバッファで各サンプルを3回洗浄します。
最後の洗浄後、PBSの300マイクロリットルでサンプルを洗浄し、チャンバースライドの壁を慎重に取り外します。下部のガラススライドだけが残るように。200マイクロリットルの取り付け媒体をガラススライドに加え、気泡を作成せずに慎重にカバースリップをサンプルに落とし、共焦点蛍光顕微鏡によるイメージングの前に一晩暗い乾燥した場所に取り付けられたサンプルを保存し、アッセイの典型的な実験セットアップと、各プロトコルの実験終了時に代表的および分析可能なサンプルの収量を観察することができる。
アガロースキャストのマイクロウェル内の1型コラーゲンに3D培養を埋め込むことで、2つの原生マウスのこの分析J.Inによる浸潤のモニタリングと分析が可能となり、膵臓癌細胞株の異なるスフェロイド形状および侵襲的挙動が観察された。第1の細胞株は、単一細胞の浸潤に対して観察されたものと同様に、よりコンパクトなスフェロイド形成およびスパイキーな侵入を実証した。第二の細胞株は、より緩いスフェロイドを形成し、集団浸潤パターンを実証しながら。
共培養は、腫瘍スフェロイド形成またはその後の腫瘍T細胞相互作用評価の際に、同時に、または腫瘍およびT細胞と同時に播種した2つの異なる腫瘍クローナル細胞株で行うことができる。侵襲的挙動の詳細な評価のために、免疫蛍光染色およびコン焦点イメージングは、高スループット方式で行うことができる。アガロースキャストは、腫瘍とT細胞の間の空間的関係を定量化するために、連続断面および免疫組織化学染色のためのパラフィン中の全体の3D培養系の埋め込みを可能にする。
例えば、T細胞浸潤は、細胞表面マーカー染色によって同定および特徴付けることができる。この技術は、患者のサンプルの分析だけでなく、腫瘍細胞T細胞相互作用をプローブするために刺激および遮断薬の使用を可能にする。
