頭頸部の癌は、ますます普及しつつある。しかし、この地域の腫瘍微小環境と治療抵抗のメカニズムに関する理解は限られています。この技術は、アクセス可能な方法で頭頸部腫瘍のネイティブ微小環境を再現するために使用することができ、ヒトに見られるものと同様の臨床症状を生成する。
腫瘍細胞培養が70%の合流度に達したら、細胞を1回の洗浄で冷たいPBSで3回洗浄し、培養フラスコの底面を覆うのに十分な0.25%トリプシンで細胞を取り付ける。細胞培養インキュベーターで3〜4分後、軽い顕微鏡下で剥離を確認し、胎児ウシ血清を添加したDMEM F12培地の12ミリリットルでトリプシンを中和する。細胞懸濁液を50ミリリットルの円錐チューブに移し、反転によって細胞を3〜4回混合する。
次いで遠心分離により細胞を採取し、血清中のペレットを再懸濁し、抗生物質を含まないDMEMを氷上の培地濃度の50マイクロリットル当たり6番目の腫瘍細胞に10回10回で再懸濁させる。注射の直前に、細胞を氷上の基質膜マトリックス比に懸濁させる腫瘍細胞を1個に1個に混合する。レシピエント動物1匹につき100マイクロリットルの細胞を備えた23ゲージの針を装備した1つの0.5ミリリットルの注射器をロードする。
注射器を氷の上に置き、麻酔付きマウスのつまみへの応答の欠如を確認します。次に、口腔内にシリンジを平行に保ち、口腔内にシリンジを平行に保ち、5秒間にわたって細胞基膜マトリックス懸濁液の100マイクロリットル体積の完全な注入を容易にするために、口の両側の利用可能なオープンスペースを通して、右または左の頬領域に針を挿入する。注射器をそっと引き出す前に、すべての材料が注入されていることを確認するために、さらに5秒間シリンジを所定の位置に保ちます。
腫瘍は約1週間でひどく見えるようになります。注射の1週間後、カリパーを使用して各腫瘍の長さと幅を測定し、週に1〜2回の腫瘍容積を決定する。そして、各動物の体重を測定して、腫瘍の増殖が摂食に及ぼす影響を評価する。
適切な実験エンドポイントで、鋭いはさみと鈍い鉗子を使用して、首の正中線を通って皮膚を切開する。そして、腫瘍を覆う皮膚の下にそっとハサミを挿入し、はさみを横切って皮膚に押し込んでエアポケットを作ります。皮膚が腫瘍から十分に剥離したら、リンパ組織の存在によって腫瘍組織が混乱することを避けるために、排出リンパ節を切除し、全容が剥離するまで腫瘍の境界を切断する。
下流の分析のために腫瘍を処理するには、腫瘍を1〜2ミリメートルの大きさに切り、コラゲラーゼ3、DNAs 1、トリプシン阻害剤を含む50ミリリットル円錐形チューブに入れる。腫瘍片を摂氏37度で30分間インキュベートした後、10分ごとに振盪し、20ミリリットルのHBSSをチューブに加え、70マイクロメートルを通してナイロンストレーナーを注ぐ。5ミリリットルのシリンジプランジャーを使用して、ストレーナーの腫瘍片をつぶし、ストレーナーを通してHBSSの10ミリリットルを追加します。
遠心分離によって細胞をスピンダウンします。厳格なピペット処理で2〜3ミリリットルの赤血球リシスバッファーでペレットを再懸濁し、室温で2分後に新鮮なHBSSの20ミリリットルでリシスを中和する。その後、別の遠心分離のためにHBSSの追加20ミリリットルで細胞を再中断し、腫瘍細胞懸濁液から最終的な破片を除去するために40マイクロメートルの注ぎフィルターを介して細胞を緊張させる。
LY2腫瘍はB4B8腫瘍と比較して、より高い割合で増殖する。そして、顎の変位を示すマウスは、嚥下障害のために急速に体重減少を発症する。また、LY2マウスの生存期間の中央値は、B4B8腫瘍を持つマウスに対して観察された半分以下である。
腫瘍を持つマウスの磁気共鳴画像は、頬粘膜の内層に広がる十分に境界された腫瘍を示すが、舌または他の近くの器官には及んでいない。組織学的検査では、すべてのLY2腫瘍を持つマウスが分化不良の扁平上皮癌を発症し、B4B8腫瘍を有するマウスは適度に分化した扁平上皮癌を発症することを示している。すべてのLY2腫瘍を持つマウスも組織学的に確認された壊死を有し、大多数は中等度から重度の壊死を示す。
本代表的実験では、LY2腫瘍を採取し、腫瘍細胞注射後3週間で処理した。CD45陽性免疫細胞は、腫瘍細胞集団全体の7.3%を表した。CD11b陽性骨髄細胞は、CD45陽性細胞の全ての37.8%を表し、その大部分はF480陽性マクロファージであると判断され、好中球および骨髄由来のサプレッサー細胞の集団も少ない。
T細胞はCD45陽性免疫細胞集団の15.9%を占め、そのうち53.4%がCD4陽性FoxP3陽性調節性T細胞であった。ナチュラルキラー細胞は、すべてのCD45陽性細胞の2%未満で構成された。針とレシピエントマウスを保持し、動物の口を露出する自信と快適さを開発するために注射を練習することが重要です。
処置が正常に行われると、腫瘍固有因子および微小環境因子の治療または評価に対する腫瘍応答の評価を含む実験が行われる。この技術は、頭頸部癌患者における放射線療法と抗PL1療法を組み合わせることの効果を評価し、研究者主導の臨床試験を設計する道を開いた。
