患者駆動型オルガノイドモデルは、遺伝的および機能的に親腫瘍を表すため、卵巣癌における新しい治療法および複雑な生物学的プロセスを研究するための信頼できるモデルです。これらのモデルは、クローンの不均一性、腫瘍微小環境、およびin vitro細胞間相互作用を再現することにより、癌細胞株および患者由来の異種移植片の限界を克服します。患者由来のオルガノイドは、長期的な拡張および保存機能を提供し、腫瘍生理機能を模倣します。
その結果、それらは新しい治療法や予測バイオマーカーの研究に理想的なモデルです。腫瘍サンプルを10センチメートルの組織培養皿に入れ、組織を細かく刻んで使い捨てメスを使用して均質な混合物を作成することにより、オルガノイドの採取を開始します。均質な組織混合物を鉗子を使用して解離チューブに入れる。
1〜2ミリリットルの均質化組織ごとに、オルガノイドベース培地中の1ミリリットルあたり1ミリグラムのタイプ2コラゲナーゼ溶液と1ミリリットルのDNase One溶液1ミリリットルを7〜8ミリリットル加えます。溶液を458 Gでボルテックスし、解離機を使用してコラゲナーゼ溶液中に組織を液化します。プログラム37CアンダースコアHアンダースコアTDKを1時間3回実行し、単一セル懸濁液となるまで実行する。
完了したら、均質化した混合物を新しい50ミリリットルの円錐管に移します。20〜40ミリリットルのオルガノイドベース培地を加え、458 Gで溶液をボルテックスし、100マイクロメートルのセルストレーナーを通して溶液をろ過して、新しくラベル付けされた50ミリリットルのコニカルチューブに入れます。次に、濾過した混合物を1,650Gで摂氏4度で5分間遠心分離し、ガラス製牧草ピペットを用いて上清を吸引する。
1ミリリットルあたり100マイクログラムのDnase Oneを調製し、滴下賢明なDNase One溶液を加えて、1ミリリットルのDnase One溶液に細胞を再懸濁します。室温で15分間インキュベートした後、25ミリリットルのオルガノイドベース培地を細胞に加え、転覆させて混合します。次に、細胞を摂氏4度で5分間1, 650 Gで遠心分離し、ガラス製牧草地ピペットを使用して上清を注意深く吸引します。
新しく形成された細胞ペレットを、5ミリリットルの予熱した赤血球またはRBC溶解バッファーに再懸濁します。各円錐管内の溶液を458 Gでボルテックスし、5分間インキュベートします。再度、RBC溶解緩衝液に懸濁したペレットを遠心分離し、ガラス製牧草ピペットを用いて上清を吸引する。
ペレットを10ミリリットルのPBSで洗浄し、細胞を遠心分離する前に細胞をボルテックスします。大きな細胞ペレットの場合は、PBSを吸引し、ペレットの上に1ミリリットルのオルガノイドベース培地を追加します。溶液をボルテックスした後、300〜400マイクロリットルの細胞懸濁液を微小遠心チューブに移します。
5分間の遠心分離後、上清を吸引し、コールドチップを使用して基底膜抽出物(BME)およびオルガノイドベース培地に再懸濁します。再懸濁した細胞溶液を40マイクロリットルのアリコートで6ウェルプレートにプレートします。ウェルあたり最大5つのアリコートをプレートします。
直ちにウェルプレートをインキュベーターに20分間置き、インキュベーション後、2ミリリットルの完全オルガノイド培地を各ウェルに静かに加えます。各ウェルに1ミリリットルのオルガノイドベース培地を加え、培地を上下にピペットでオルガノイドタブ上に直接ピペットで入れて解離させます。再懸濁したペレットを含むすべての培地を15ミリリットルのコニカルチューブに集めます。
次いで、混合物を入れた15ミリリットルのコニカルチューブを5分間遠心分離してから上清を吸引する。1ミリリットルの動物由来の遊離組換え酵素を細胞ペレットに加える。ボルテックスによって混合し、懸濁液を1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。
摂氏37度のウォーターバス中で15分間インキュベートし、5分間遠心分離した後、上清を吸引する。ペレットをBMEおよびオルガノイドベース培地に再懸濁し、再懸濁した細胞溶液を40マイクロリットルのアリコートで6ウェルプレートにプレートします。ウェルあたり最大5つのアリコートをプレートします。
20分間のインキュベーション後、2ミリリットルの完全オルガノイド培地を各ウェルに静かに加えます。継代オルガノイド細胞ペレットを0.5〜1ミリリットルの回収細胞培養凍結培地に再懸濁し、各クライオバイアルに1ミリリットルを移してから、マイナス80度と液体窒素タンクに移して長期保存します。液体窒素に保存されたクライオバイアルを摂氏37度の水浴に移してオルガノイドを解凍します。
解凍したら、オルガノイドを15ミリリットルのコニカルチューブに移し、遠心分離してから上清を吸引します。次に、ペレットに1ミリリットルのPBSを加え、再懸濁したペレットを1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移し、摂氏4度で1,650Gで5分間遠心分離した後、ガラス製牧草ピペットを用いて上清を注意深く吸引する。ペレットをBMEおよびオルガノイドベース培地に再懸濁し、再懸濁した細胞を40マイクロリットルのアリコートで6ウェルプレートにプレートします。
ウェルごとに最大5つのアリコートを配置します。プレートを直ちにインキュベーターに20分間入れてから、2ミリリットルの完全オルガノイド培地をウェルに加えます。オルガノイドは10日間にわたって樹立され、その後、培養において個別のオルガノイドが示されました。
患者由来のオルガノイド培養は、それらをアガロースに包埋し、ヘマトキシリンおよびエオジン染色で評価することによって評価されました。BMEと協力する際の課題を考慮することが重要です。セルペレットとBMEの再懸濁は、プロセスで気泡が形成されないように氷上で行う必要があります。
この技術により、ネオアジュバント化学療法を受けた患者が直面する問題によるオルガノイドの生成と発達に対する化学療法の影響に関するさらなる研究が可能になります。
