シングルセルシーケンシングのためのナイルティラピア腸からのシングルセル懸濁液調製(英語)

このプロトコルは、ナイルティラピア腸から高品質のシングルセル懸濁液を調製し、養殖魚種のシングルセルレベルの研究を促進するための信頼できるリファレンスを提供します。この技術は非常に効率的で、ほとんどの実験室条件で実装できます。これにより、水産養殖魚種の単一細胞懸濁液を調製するための追加の試験の必要性が減少します。

生後6か月のナイルティラピアの魚をよく通気した滅菌水で15分間すすぎ、表面から緩く結合したバクテリアを洗い流すことから始めます。酵素細胞解離試薬を調製するには、コラゲナーゼディスパーゼをPBSで1ミリリットルあたり1ミリグラムの最終濃度に希釈します。調製した酵素溶液の95%容量とFBSの5%容量を混合します。

次に、使用前に遠心分離機を摂氏4度に予冷しました。組織解剖のために、安楽死させた魚を氷の上に置き、腸の中央部の3〜4センチメートルを収集します。鉗子を使用して脂肪と腸間膜を切除します。

腸の表面に付着した脂肪と弾力性と順応性のある透明な粘膜を取り除きます。注射器を使用して滅菌氷冷PBSで腸の断片をそっとすすぎ、腸の内容物と粘液を洗い流します。数回洗浄した後、断片を小片に解剖し、1ミリリットルの氷冷PBSを含む1.5ミリリットルのチューブに移します。

混合物を300 x gで摂氏4度で5分間遠心分離します。そして、上清を1ミリリットルの氷冷0.08%BSA-DPBSと交換します。ガラスピペットを使用して、組織片を再懸濁するために穏やかに吸引する。

小片をもう一度洗浄した後、上清を取り除き、調製した酵素解離試薬1ミリリットルを加える。また、5マイクロリットルのRNA阻害剤をシングルセルRNAシーケンシング用の解離試薬と混合します。チューブを摂氏37度の強化水浴に置き、30〜60分のインキュベーション時間の間、5分ごとにチューブを手動で反転させます。

チューブを回転させたら、ワイドボアチップを使用して酵素細胞解離試薬を除去します。氷冷した0.08%BSA-DPBSを1ミリリットル加え、細胞破壊を防ぐために細胞を静かに上下にピペットで移します。遠心分離し、細胞をもう一度再懸濁した後、0.08%BSA-DPBSで事前に湿潤させた40マイクロメートルのセルストレーナーを50ミリリットルの円錐管に置きます。

細胞懸濁液をストレーナーに通します。ストレーナーをタップしてから、200マイクロリットルのDPBSですすぎ、チューブの底に懸濁液を集めます。懸濁液を1.5ミリリットルのチューブに移した後、5マイクロリットルのDNAを加え、懸濁液を摂氏15〜20度で15分間インキュベートします。

遠心分離したら、上清を除去し、カルシウムイオンとマグネシウムイオンを含まない400マイクロリットルの氷冷DPBSに細胞ペレットを再懸濁します。次に、ワイドボアチップでゆっくりと上下にピペットで細胞を混合し、このプロセスをもう一度繰り返します。染色のために、細胞懸濁液を0.4%トリパンブルー溶液に等比率で混合し、室温で3分間インキュベートします。

次に、スライドガラス上に10マイクロリットルの混合物を加える。顕微鏡下で生細胞と死細胞を3つのフィールドでカウントし、細胞生存率を計算します。一般的に使用されるいくつかの酵素の解離効率を比較した。

コラゲナーゼディスパーゼミックスは、コラゲナーゼディスパーゼまたはトリプシン単独および他のいくつかの酵素混合物よりも優れた解離効果を有することが確認された。顕微鏡検査では、腸細胞は生存率が高く、単一細胞として分散していることが示されました。ほとんどの細胞は生存可能でしたが、細胞膜が透過したために死に染色された細胞もいくつかありました。

使用するPBSの種類に注意してください。酵素は効果的に機能するためにカルシウム/マグネシウムイオンを必要とするため、酵素はカルシウム/マグネシウムを含まないPBSで酵素消化溶液を使用することはできません。この手順は、養殖魚種の単一細胞レベルの研究を容易にし、養殖魚種の細胞解離プロトコルを開発するための貴重な参考資料を提供します。