この簡単で再現性のあるプロトコルは、健康なマウスモデルマウスモデル肝臓、およびヒトおよび非ヒト霊長類の肝臓から高品質の核を単離するために成功裏に使用されました。この方法は、少量の凍結組織材料のみを必要とする。また、密度グレードのインセンティブは、肝臓のすべての主要な細胞タイプが最終的な核調製で保存された非常にクリーンな核懸濁液を提供します。
核抽出のこの方法は、バイオバンクに保存されているバイオアーカイブされたヒト肝臓サンプルに使用できます。事前に冷やしたメスを使用して、ドライアイス上のペトリ皿に置かれた肝臓組織から2230ミリグラムまたは5ミリメートルの立方体片を切り取ることによって、組織の均質化を開始します。すぐにペトリ皿を湿った氷に移し、1ミリリットルのホモジナイズバッファーを加えます。
冷たいメスを使用して、できるだけ組織を細かく刻み、1ミリリットルの幅の開口部の先端で吸引できるようにします。組織懸濁液を収集し、事前に冷却した2ミリリットルのガラスダウンスホモジナイザーに移します。追加の0.521ミリリットルのホモジナイズバッファーでペトリ皿を洗浄し、すべてを氷上に保ちながら残りの組織片をすべて収集します。
泡を作らずに氷上で緩い乳棒Aでゆっくりと慎重に5ストロークを実行します。乳棒がストロークごとにホモジナイザーの上部から下部に注意深く移動することを確認します。その後、泡を作らずに氷上でタイトな乳棒Bで10〜15回のスローストロークを実行します。
完了したら、ホモジネートを50マイクロメートルのセルストレーナーでろ過し、事前に冷却した1.5ミリリットルのチューブに移します。結合組織の塊を大量に含むホモジネートには、複数のフィルターまたはチューブを使用してください。ホモジナイザーとフィルターを追加の0.521ミリリットルのホモジナイズバッファーですすぎ、密度勾配遠心分離の前にすべての組織ホモジネートを完全に収集します。
密度勾配遠心分離では、ろ過したホモジネートを1000 Gのプレチルド固定角遠心分離機で摂氏4度で8分間遠心分離します。サンプルを遠心分離している間に、250マイクロリットルの50%ヨージキサノール希釈液を含む1.5ミリリットルチューブと、500マイクロリットルの29%ヨージキサノール希釈液を含む1本の2ミリリットルチューブを準備します。両方のチューブを氷の上に置きます。
次いで遠心分離機懸濁液から、真空ポンプを用いてペレットを乱すことなく上清を吸引する。1ミリリットル幅のオリフィスピペットチップを使用して、ペレットを250マイクロリットルのホモジナイズバッファーに再懸濁します。次に、250マイクロリットルの核懸濁液を、250マイクロリットルの50%ヨージキサノールを含む事前に冷却された1.5ミリリットルのチューブに移し、穏やかかつ完全に混合して、25%ヨージキサノール核懸濁液を生成します。
次に、500マイクロリットルの25%ヨージキサノール核懸濁液を、500マイクロリットルの29%ヨージキサノール希釈液を含むミリリットルチューブのプレチルドチューブに移す。ブレークをオフに設定して、12, 500 Gのプレチルドスイングバケット遠心分離機でチューブを20分間遠心分離します。遠心分離ステップが完了する直前に、RNA阻害剤を核保存バッファーまたはNSBに追加し、単一核RNAシーケンシングパイプラインに進みます。
遠心分離終了後、真空ポンプを用いてペレットを乱すことなく上清を吸引する。1ミリリットル幅のオリフィスピペットチップを使用してペレットを100〜300マイクロリットルのNSBに静かに再懸濁し、核懸濁液を清潔なプレチルド1.5ミリリットルチューブに移します。手動血球計算盤でトリパンブルー溶液を使用して核を数え、得られた核懸濁液をすぐに単一核ゲノミクスアッセイに使用します。
フローサイトメトリーベースの細胞ソーティングでは、核懸濁液を50マイクロメートルのフィルターを通して、事前に冷却された5ミリリットルの蛍光活性化セルソーティングまたはファックスチューブにろ過します。サンプルをプレビューする前に、100マイクロメートルのノズルを備えたフローサイトメトリーソーターを使用し、ファックスチューブをソーターにロードします。核の並べ替えのゲーティング戦略を設定し、前方散乱領域と側方散乱領域をプロットしてスキャッターゲートから始め、次にデマの高さとデマ領域、デマ幅とデマ領域をプロットします。
デマされた領域のヒストグラムで核倍数性プロファイルを視覚化します。96または384ウェルプレートにソーティングする場合は、液滴遅延を設定し、カラーメトリック法を使用してプレートアライメントを最適化します。サンプルの冷却とプレートホルダーを摂氏4度に設定し、サンプルの回転を300RPMでオンにします。
1ミリリットルあたり約10〜5番目の核のサンプル濃度で、毎秒200〜500イベントの流速で単一核を分類します。凍結肝臓から抽出した核の顕微鏡検査は、密度勾配遠心分離ステップが不要な細胞および組織の破片の除去を大幅に促進することを示しました。この方法論は、すべてのレベルの倍数性を維持し、サイトメトリー分析によって検証および定量化されました。
核抽出を使用して得られたデータから高品質の指標が観察されました。一様なマニホールド近似と投影は、すべての核と主要な細胞タイプにわたるカウント数を表し、核トランスクリプトームと比較的浅いシーケンシングでのみ自信を持って識別できます。このアプローチにより、生体異物の代謝に関与する肝臓特異的転写因子および下流の標的遺伝子の調査が可能になりました。
中心部CYP2E1、および門脈周囲CYP2F2などの特徴的な遺伝子の相補的なパターンは、抽出された核が肝臓提供に関する重要な情報を保持していることを示しました。RNAの遺伝子発現ライブラリーは核当たり44, 600リードの深さまで配列決定され、ATACライブラリーは核当たり43, 500リードの深さまで配列決定された。SeuratパッケージとSignacパッケージを使用して、RNAとATACの両方のモダリティの複数の測定に対して実行された重み付き最近傍分析により、細胞サイズや核の脆弱性による顕著なバイアスなしに、主要肝細胞とマイナー肝細胞タイプの識別と注釈が可能になりました。
上流の転写調節因子と肝提供の特徴遺伝子もこの方法で検出されました。乳棒を上下に動かすときに、ダウンの均質化中に気泡をあまり作成しないようにし、プロトコルに示されているストローク数に固執することが重要です。
