このプロトコルは、in vivo研究の前にワクチンの免疫原性を測定するためにウシ単球由来の樹状細胞を使用する機能的なin vitroアッセイを表しています。したがって、家畜ワクチン学における既存のギャップを埋める。樹状細胞の生成と応用です。
最も強力な抗原提示細胞として、樹状細胞はワクチンの有効性を含む細胞内免疫メカニズムを理解するための重要な研究標的となっています。このアッセイは、ワクチン候補のスクリーニング、ワクチン製造の品質管理状態、抗原およびアジュバントの選択のためのツールとして実施できます。手順を実演するのは、動物生産および健康研究所の科学者であるリチャード・カンゲテです。
子牛の頸静脈穿刺から得られた血液を反転させてヘパリン化真空と混合することから始めます。次に、20ミリリットルのヘパリン化血液を滅菌50ミリリットルのチューブに移し、10ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水またはPBSで希釈します。15ミリリットルのリンパ球分離培地を滅菌50ミリリットルのチューブにピペットで入れ、チューブを45度の位置に傾けます。
25ミリリットルのピペットを使用してリンパ球分離の上に30ミリリットルの血液PBS培地を注意深く重ね、チューブをゆっくりと垂直位置に戻してから遠心分離します。次に、パスツールピペットを使用して末梢血単核細胞の薄い白い層またはPBMC層を収集し、それを新しい50ミリリットルのチューブに移します。収穫したPBMCを1回の洗浄で40ミリリットルのPBSで2回洗浄し、よく混ぜます。
遠心分離後、ペレットを15ミリリットルの塩化アンモニウムカリウム緩衝液またはACK緩衝液に再懸濁する。室温で10〜15分間インキュベートした後、最大40ミリリットルのPBSを加え、最大の加速と減速でチューブを遠心分離します。ペレットを10ミリリットルの完全培養培地に再懸濁します。
次に、1000万細胞あたり5マイクロリットルのCD14マイクロビーズバッファーを加え、ピペットを使用して十分に混合します。フローサイトメトリー分析では、10マイクロリットルのCD14フルオレセインイソチオシアネートまたはFITC染色抗体をPBMCに加え、摂氏4〜8度で15分間インキュベートしてから、フローサイトメトリーを進めます。染色されていないPBMCに1ミリリットルのファックスバッファーを加え、500g、摂氏4度で7分間遠心分離します。
次に、ペレットを1億細胞あたり500マイクロリットルのファックスバッファーに再懸濁します。次に、免疫磁気細胞分離カラムを分離器に挿入し、フロースルーを回収するためのカラム出口の下に50ミリリットルの収集チューブを置きます。1ミリリットルの脱気ファックスバッファーでカラムを洗浄した後、使用済みの15ミリリットルのチューブを新しいものと交換します。
一度に500マイクロリットルのバッファーに1億個の細胞をピペットで入れ、細胞懸濁液をカラムに通過させます。次に、毎回3ミリリットルの脱気ファックスバッファーでカラムを3回すすぎます。フロースルーを回収した後、最初に溶出したナイーブリンパ球画分をCD14陰性細胞画分として標識する。
カラムをセパレーターから取り外し、廃液収集のためにカラムの下に新しい滅菌15ミリリットルチューブを置きます。5ミリリットルのファックスバッファをカラムに追加し、プランジャーを使用してすぐに押し込みます。2番目のフロースルー画分またはナイーブ単球画分を収集し、CD14陽性細胞画分としてラベル付けします。
採取したCD14陽性単球に完全培養液を加えて、ミリリットルあたり100万細胞を達成します。次に、キットに付属のサイトカインカクテル40マイクロリットルを各ウェルに補給する前に、滅菌24ウェルプレートの各ウェルに1ミリリットルの細胞懸濁液を追加します。2日目に、ピペットを使用して各ウェルの内容物の半分を個々の1.5ミリリットルチューブに移します。
1.5ミリリットルのチューブを500gで7分間遠心分離した後、上清を廃棄し、ペレットを500マイクロリットルの新鮮な完全培養培地に再懸濁します。この再懸濁した細胞懸濁液500マイクロリットルを対応するウェルに戻して、ウェル内の最終容量が1ミリリットルになるようにします。20マイクロリットルのサイトカインカクテルで各ウェルを強化します。
抗原パルスMoDCを生成するには、狂犬病ウイルスワクチンまたはRV懸濁液1ミリリットルあたり1マイクロリットルを24ウェルプレートのナイーブMoDC培養液1ミリリットルに加え、プレートを5%二酸化炭素および摂氏37度で48時間インキュベートします。7日目に、抗原パルスMoDCを含む24ウェルプレートを氷上に10分間保持してから、ウェルあたり1ミリリットルの氷冷PBSを加えて完全に混合します。懸濁液を15ミリリットルのチューブに移します。
2ミリリットルの氷冷PBSでウェルを洗います。各ウェル内の残留細胞を収集し、洗浄した内容物をそれぞれのチューブに移します。細胞懸濁液を500gで7分間遠心分離します。
上清を廃棄した後、抗原パルスMoDCs細胞ペレットを完全培養培地に再懸濁し、ミリリットル当たり100, 000細胞に最終濃度を調整した。MoDCリンパ球共培養では、抗原パルスの7日目に、滅菌24ウェルプレートのウェルに1ミリリットルのナイーブリンパ球細胞懸濁液と1ミリリットルの抗原パルスまたは非抗原パルスMoDC懸濁液を播種します。2日間のインキュベーション後、各ウェルにミリリットル当たり20ナノグラムの組換えインターロイキン-2を補給し、さらに120時間インキュベーションを続ける。
14日目に、1ミリリットルの共培養を滅菌1.5ミリリットルのチューブに移し、チューブを遠心分離します。次に、細胞ペレットを1ミリリットルの抗原パルスまたは非パルスMoDCで再懸濁します。よく混合し、細胞懸濁液を対応するウェルに移します。
PBMCならびにナイーブリンパ球および単球の細胞表面染色後、1ミリリットルの細胞懸濁液をピペットおよび遠心分離機を用いて滅菌1.5ミリリットルチューブに500gで10分間移す。次に、ペレットを1ミリリットルのPBSに再懸濁し、15ミリリットルのチューブに移します。また、1ミリリットルのPBSを使用して残留細胞と対応するチューブを収集します。
次に、細胞を含む15ミリリットルのチューブに10ミリリットルのPBSを加え、ピペッティングで混合します。チューブを850gで7分間遠心分離した後、上清を除去し、上清をデカントした後に残った懸濁液とともに細胞ペレットを注意深く再懸濁します。細胞懸濁液をV底の96ウェルプレートに移し、こぼれないようにウェルを密封します。
染色が完了したら、フローサイトメーター分析を実行します。リアルタイムプレビューから、電圧、ゲイン、細胞サイズなどの蛍光の閾値を調整して、細胞の破片を排除しながら、目的の細胞集団の周囲にゲートを描画します。CD14細胞染色およびフローサイトメトリーは、ナイーブ単球画分が98%CD14陽性単球細胞を含み、機能的に抗原取り込み可能であることを示した。
MHCクラス2および共刺激性CD86およびCD40細胞表面マーカーの発現を評価することによって特徴付けられるナイーブMoDCの表現型は、樹状細胞またはDC様表現型を検証した。9日目のMoDCリンパ球共培養中に、MoDCへのRVパルスに樹状突起の伸長を示す形態学的変化が観察された。非パルスMoDCリンパ球培養と比較して、パルスMoDCリンパ球共培養の16日目にCD4陽性およびCD8陽性T細胞上のKi67およびCD25活性化マーカーのアップレギュレーションによってリンパ球増殖の有意な増加が実証された。
成熟RVパルスMoDC共培養からのCD8陽性T細胞は、非特異的群と比較してKi67の8倍のアップレギュレーションを示した。同じ共培養のCD4陽性細胞は、対照と比較してKi67の7倍の増加を示し、RVプライミングMoDCがRV抗原をナイーブリンパ球に提示し、in vitro条件でそれらを活性化する能力を示しました。共培養のqPCR定量は、GAPDHをキャリブレーターとして使用するすべての共培養において、インターフェロンガンマ発現の30%以上の増加およびKi67発現の5%以上の増加を示した。
分泌されたインターフェロンガンマの有意な濃度は、非特異的治療群と比較してRVパルスMoDCリンパ球共培養において観察された。重ね合わせステップを非常にゆっくりと慎重に実行し、血液がリンパ球分離培地の上に置かれていることを確認します。他のレイヤーからあまり多くの材料を収集しないように、すべてのPBMCを収集するように特に注意してください。
フローサイトメトリー、ELISA、定量PCRなどの他の方法は、この手順の後に免疫マーカーの活性化を評価するために適用できます。
