この研究は、ブラジルの国家科学技術開発評議会(CNPq)[助成金番号428048/2018-8および402556/2022-4]とブラジリア大学(ブラジル)から資金提供を受けました。著者は、この研究で使用したスマートフォンへのアクセスを提供してくれたDuarte Nuno Carvalho博士とEvelyn Santos博士(i3s、ポルトガル、ポルト)に感謝します。

1. ブラッドフォードタンパク質アッセイ試薬の調製
<ol><li>100 mgのクマシーブリリアントブルーGを50 mLの95%(w/v)エタノールに溶解します。クマシーブリリアントブルーGが完全に溶けるまで混ぜます。 注意: エタノールは可燃性であり、目の炎症を引き起こします。炎を避け、ゴーグルを使用してください。</li>
	<li>前の溶液に、100 mLの85%(w / v)リン酸を注意深く加えます。 注意: リン酸は金属を腐食し、皮膚の腐食、深刻な眼の損傷、および急性経口毒性を引き起こします。手袋とゴーグルを着用してください。</li>
	<li>クマシーブリリアントブルーG、エタノール、リン酸を含む溶液を600 mLの脱イオン水にゆっくりと加えます。</li>
	<li>溶液を最終容量1,000 mLに希釈します。分析するサンプルの数に応じてスケールアップまたはスケールダウンします。元のメソッド7 に記載されているように、作業中の Bradford 試薬の最終濃度は、0.01% (w/v) の Coomassie Brilliant Blue G、4.7% (w/v) のエタノール、および 8.5% (w/v) のリン酸です。</li>
	<li>ろ紙(Whatman#1紙または同等品)でろ過された不溶性材料を取り除きます。</li>
	<li>この試薬は、室温(RT)で保存し、光から保護すると、数週間安定しています。時間の経過とともに沈殿物が形成される可能性があるため、必要に応じてろ過してください。 注:あるいは、すぐに希釈して使用できるブラッドフォード試薬が市販されています。試薬を調製するための製造元の指示に従い、次のステップに進みます。</li>
</ol>2. 蛋白質標準液の調製
<ol><li>標準として使用する単離タンパク質のストック溶液(ステップ2.4を参照)を調製します。手頃な価格で一般的に使用されているタンパク質は、ウシ血清アルブミン(BSA)です。他の選択肢は、オボアルブミンとウシガンマグロブリンです。</li>
	<li>標準物質として用いるタンパク質のモル吸収率がわかっている場合は、分光光度計で原液の濃度を確認してください。</li>
	<li>BSA の場合、一般的に使用される式は BSA (mg/mL) = (A280/6.6) × 10 であり、ここで A280 は、適切なブランクに対して読み取られた光路長 1 cm の 280 nm での吸光度です(つまり、ε2801% = 6.6)7。例えば、0.8 mg/mL BSA の吸光度は 280 nm で 0.528 です。</li>
	<li>検量線を生成するには、0.025 mg/mL から 1.0 mg/mL の範囲で BSA を数倍希釈します。これらは、ウェルあたり10μLのサンプル量を追加した後、ウェルあたり0.25〜10μgのBSAになります。 注:タンパク質標準溶液は、サンプルの調製に使用した培地と同じ組成(最終濃度)の培地で調製する必要があります。</li>
</ol>3. アッセイ
<ol><li>サンプルを希釈して、タンパク質濃度が標準曲線の 0.025-1.0 mg/mL の範囲内に収まるようにします。範囲内に複数(少なくとも 3 つ)のサンプル希釈がある。 注:サンプルは、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)またはブラッドフォード試薬と互換性のあるその他の培地/緩衝液組成物で希釈できます。培地成分の最終濃度は、標準試料とサンプルで異なるべきではありません。</li>
	<li>各タンパク質標準溶液 10 μL を 96 ウェルマイクロプレートの 3 ウェル(3 ウェル)に添加します。タンパク質ポイントが 0(ゼロ)の場合は、標準溶液の調製に使用したバッファー/培地を 10 μL 添加し、サンプルを希釈します。</li>
	<li>別のウェルセットに、同じ 96 ウェルマイクロプレートの 3 つのウェル(つまり、3 回に分けて)に希釈した各サンプル 10 μL を加えます。1つのアプローチは、異なる容量のサンプルを添加し、ウェルあたり最大10 μLの培地(例えば、0.5 μL、1 μL、2 μL、4 μL、8 μLのサンプルと、9.5 μL、9 μL、8 μL、6 μL、2 μLの培地)で完成させることです。</li>
	<li>250 μLのBradfordタンパク質アッセイ試薬をすべてのウェルに加えます。典型的なマイクロプレートのセットアップを 図 2 に示します。この例では、260 μL(ウェルあたりの最終容量)の水を含むブランクウェルのセットを、マイクロプレートリーダーのブランクとして含めました(ステップ4.5)。これは、吸光度データも収集する場合にのみ必要です。 注:アッセイを行うたびに、サンプルの同じマイクロプレートに検量線を調製してください。つまり、サンプル数に応じて別のプレートが必要な場合は、2枚目のプレートに別の検量線を用意します。</li>
	<li>5〜15分以内に結果(セクション4)を記録します。</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65547/65547fig02v2.jpg"> 図2:Bradfordタンパク質アッセイの典型的なプレートレイアウト。 ブランクとは、マイクロプレートリーダーでブランクとして使用する260μLの水を含む3つのウェルを指します。STDとは、タンパク質の標準物質を指します。S1-S6 は 6 つの異なるサンプルです。SX_1-SX_4は、サンプルごとに 4 つの異なるサンプル希釈液です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65547/65547fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
4. 結果の記録
<ol><li>明るい部屋で、マイクロプレートをベンチと平行に、均一な白い背景(紙シートなど)を片手で持ちます。プレートに水準器を配置して、正確な位置合わせを確保します。</li>
	<li>一方、スマートフォンをベンチとマイクロプレートに平行に持ち(一部のカメラアプリケーションはデバイスの傾きを便利に示します)、マイクロプレート全体の写真を1枚または数枚撮影します(図3)。iOSデバイスでは、 グリッド オプションを有効にして、カメラ設定でカメラレベルインジケーターをオンにします。Android デバイスでは、 フレーミング ヒントを有効にして、カメラ設定でカメラ レベル インジケーターをオンにします。</li>
	<li>特別な照明器具は必要ありませんが、影や反射に注意してください。例えば、スマートフォンでプレートや背景を陰影化したり、マイクロプレートで背景を陰影化したりしないでください。井戸領域の端の小さな反射は問題ではありません。カラーデータは、各ウェルの中央にある非常に小さな領域から抽出できます。</li>
	<li>背景の均一性、影、反射について画像を簡単に確認します。また、井戸の角度を見てください。各井戸の中心は、直接見えるようにする必要があります(つまり、井戸の壁の後ろではありません)。</li>
	<li>マイクロプレートの吸光度測定値とピクチャーカラーデータの比較が必要な場合は、マイクロプレートリーダー21で590nmと450nmのマイクロプレートを読み取ります。</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65547/65547fig03v2.jpg"> 図3:ブラッドフォードタンパク質アッセイの結果をキャプチャ 。明るい部屋では、マイクロプレートを片手で均一な背景に対してベンチと平行に配置します。一方、スマートフォンはベンチとマイクロプレートに平行に保持されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65547/65547fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
5.カラーデータの抽出-自動
<ol><li>ImageJ と ReadPlate22 のダウンロード、ImageJ プラグインは https://imagej.nih.gov/ij/plugins/readplate/index.html (これは .txt ファイルです) から入手できます。</li>
	<li>ImageJ を開き、[プラグイン] > [インストール ] をクリックして、手順 6.1 でダウンロードしたファイルを選択します。</li>
	<li>[分析]>[測定値の設定]をクリックして測定パラメータを設定し、次のオプションをオンにします。標準偏差;最小および最大のグレー値。平均グレー値。モーダルグレー値。ウィンドウの下部で、[リダイレクト] を [なし] と [小数点以下の桁数 (0-9): 3] に設定します。</li>
	<li>[ファイル]>[開く]に移動し、手順4で撮影したマイクロプレートの写真を選択します。</li>
	<li>ReadPlate>プラグインに移動します。指示を読み、[OK] をクリックします。</li>
	<li>ウェルの数を 96 から選択します。</li>
	<li>プラグインによって自動的にロードされる 矩形選択 ツールを使用して、A1ウェルの中心から始まり、H12ウェルの中心で終わる長方形を作成します。次に、「 OK」をクリックします。</li>
	<li>青チャンネルを選択し、「OK」をクリックします。</li>
	<li>[ OK]をクリックして、デフォルトのパラメータを確認します。</li>
	<li>ソフトウェアが各ウェル内の領域を描写しているかどうか、および選択した領域が異常な影や反射で領域を覆っていないかどうかを確認します。[ OK] をクリックします。</li>
	<li>結果を保存し、緑チャンネルに対して手順5.8〜5.10を繰り返します。</li>
	<li>青と緑の比率は、各色のモードを使用して計算します。 注意: 計算は、手動で行うことも、R、Microsoft Excel、GraphPad Prismなどのリーダー設定のソフトウェアを使用して行うこともできます。</li>
</ol>6.カラーデータの抽出-手動
<ol><li>無料のオープンソースグラフィックエディタであるInkscapeをダウンロードしてください。 注意: カラーピッカーツール(通常はスポイトとして描かれています)を備えたソフトウェアを使用して、色を識別し、RGBデータを抽出できます。</li>
	<li>Inkscapeを開き、[ファイル]>[開く]に移動します。手順4で撮影したマイクロプレートの画像を選択します。</li>
	<li>左上に矢印で表示されている オブジェクトの選択と変換(S) ツールを選択し、画像をクリックします。破線の境界線は、選択を示します。</li>
	<li>左側にスポイトとして描かれている 画像から色を選択(D) ツールを選択します。</li>
	<li>ウェルの中央をクリックします。それに応じて、下部パネルの色(「塗りつぶし:」)が変わります。色をクリックすると、右側に [塗りつぶしとストローク ]タブがポップアップ表示されます。</li>
	<li>[ フラットカラー] ドロップダウンメニューを [RGB]に変更します。各ウェルの青と緑のチャンネルに表示された値を記録します。</li>
	<li>記録された値を使用して、青と緑の比率を計算します。 注意: 計算は、手動で行うことも、R、Microsoft Excel、GraphPad Prismなどのリーダー設定のソフトウェアを使用して行うこともできます。</li>
</ol>7. 検量線の作成と未知数の外挿
<ol><li>緑と青の平均強度比をタンパク質標準濃度の関数としてプロットします。 注: データは手動で印刷するか、R、Microsoft Excel、GraphPad Prism などのリーダー設定のソフトウェアを使用してプロットします。</li>
	<li>各サンプルと希釈液の平均緑と青の強度比を計算します。</li>
	<li>サンプルで得られたシグナルがタンパク質標準試料の線形範囲内にあるかどうかを確認します。</li>
	<li>検量線の最小値または最大値を下回る値または上回る値は無視します。</li>
	<li>検量線を表す線形方程式を使用して、サンプル中のタンパク質の量を推定します。それに応じて、計算値に希釈係数を掛けます。</li>
</ol>

Bradford Assayを使用してタンパク質を定量する分析デバイスとしてのスマートフォン

<ol>
	<li>Zaguri, M., Kandel, S., Rinehart, S. A., Torsekar, V. R., Hawlena, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+quantification+in+ecological+studies:+A+literature+review+and+empirical+comparisons+of+standard+methodologies.">Protein quantification in ecological studies: A literature review and empirical comparisons of standard methodologies.</a> Methods in Ecology and Evolution. 12 (7), 1240-1251 (2021).</li><li>Koga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mild+electrical+stimulation+and+heat+shock+ameliorates+progressive+proteinuria+and+renal+inflammation+in+mouse+model+of+Alport+syndrome.">Mild electrical stimulation and heat shock ameliorates progressive proteinuria and renal inflammation in mouse model of Alport syndrome.</a> PLoS One. 7 (8), e43852 (2012).</li><li>Peterson, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+total+protein.">Determination of total protein.</a> Methods in Enzymology. 91, 95-119 (1983).</li><li>Goldfarb, A. R., Saidel, L. J., Mosovich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ultraviolet+absorption+spectra+of+proteins.">The ultraviolet absorption spectra of proteins.</a> The Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 397-404 (1951).</li><li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li><li>Datki, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+BisANS+fluorescent+dye+for+developing+a+novel+protein+assay.">Application of BisANS fluorescent dye for developing a novel protein assay.</a> PLoS One. 14 (4), e0215863 (2019).</li><li>Van Noorden, R., Maher, B., Nuzzo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+top+100+papers.">The top 100 papers.</a> Nature. 514 (7524), 550-553 (2014).</li><li>. Scopus Available from: <a target="_blank" href="https://www.scopus.com/">https://www.scopus.com/</a> (2022)</li><li>Compton, S. J., Jones, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+dye+response+and+interference+in+the+Bradford+protein+assay.">Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay.</a> Analytical Biochemistry. 151 (2), 369-374 (1985).</li><li>Chial, H. J., Thompson, H. B., Splittgerber, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spectral+study+of+the+charge+forms+of+Coomassie+Blue+G.">A spectral study of the charge forms of Coomassie Blue G.</a> Analytical Biochemistry. 209 (2), 258-266 (1993).</li><li>Pande, S. V., Murthy, M. S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+micro-Bradford+procedure+for+elimination+of+interference+from+sodium+dodecyl+sulfate,+other+detergents,+and+lipids.">A modified micro-Bradford procedure for elimination of interference from sodium dodecyl sulfate, other detergents, and lipids.</a> Analytical Biochemistry. 220 (2), 424-426 (1994).</li><li>Gogstad, G. O., Krutnes, M. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+in+cell+suspensions+using+the+Commassie+brilliant+blue+dye-binding+assay.">Measurement of protein in cell suspensions using the Commassie brilliant blue dye-binding assay.</a> Analytical Biochemistry. 126 (2), 355-359 (1982).</li><li>Friedenauer, S., Berlet, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+and+variability+of+the+Bradford+protein+assay+in+the+presence+of+detergents.">Sensitivity and variability of the Bradford protein assay in the presence of detergents.</a> Analytical Biochemistry. 178 (2), 263-268 (1989).</li><li>Stoscheck, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+uniformity+in+the+response+of+the+Coomassie+blue+G+protein+assay+to+different+proteins.">Increased uniformity in the response of the Coomassie blue G protein assay to different proteins.</a> Analytical Biochemistry. 184 (1), 111-116 (1990).</li><li>Zor, T., Selinger, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linearization+of+the+Bradford+protein+assay+increases+its+sensitivity:+Theoretical+and+experimental+studies.">Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: Theoretical and experimental studies.</a> Analytical Biochemistry. 236 (2), 302-308 (1996).</li><li>Gee, C. T., Kehoe, E., Pomerantz, W. C. K., Penn, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+protein+concentrations+using+smartphone+colorimetry:+A+new+method+for+an+established+test.">Quantifying protein concentrations using smartphone colorimetry: A new method for an established test.</a> Journal of Chemical Education. 94 (7), 941-945 (2017).</li><li>de Camargo, C., Vicentini, M., Gobbi, A., Martinez, D., Lima, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smartphone+for+point-of-care+quantification+of+protein+by+Bradford+assay.">Smartphone for point-of-care quantification of protein by Bradford assay.</a> Journal of the Brazilian Chemical Society. 28 (4), 689-693 (2016).</li><li>Moreira, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RGBradford:+Accurate+measurement+of+protein+concentration+using+a+smartphone+camera+and+the+blue+to+green+intensity+ratio.">RGBradford: Accurate measurement of protein concentration using a smartphone camera and the blue to green intensity ratio.</a> Analytical Biochemistry. 655, 114839 (2022).</li><li>Ernst, O., Zor, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linearization+of+the+Bradford+Protein+Assay.">Linearization of the Bradford Protein Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (38), 1918 (2010).</li><li>Angelani, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+metabolic+control+analysis+approach+to+introduce+the+study+of+systems+in+biochemistry:+the+glycolytic+pathway+in+the+red+blood+cell:+Metabolic+control+analysis+and+the+glycolytic+pathway.">A metabolic control analysis approach to introduce the study of systems in biochemistry: the glycolytic pathway in the red blood cell: Metabolic control analysis and the glycolytic pathway.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (5), 502-515 (2018).</li></ol>

著者は、宣言すべき利益相反を持っていません。

この論文では、スマートフォンのカメラを使用してブラッドフォードタンパク質アッセイからのデータを記録し、カラーデータを抽出し、生物学的サンプル中のタンパク質レベルを正確に定量する方法であるRGBradfordについて説明します。元のRGBradfordメソッドとの違いの1つは、ここではImageJプラグイン22 でカラーデータを自動的に取得する手順が用いられ?...

下流の用途(ELISA、酵素動態、ウェスタンブロッティング、タンパク質精製、質量分析など)にかかわらず、ライフサイエンスラボでの正確な分析にはタンパク質の定量が不可欠です。二次読み出し(タンパク質の質量あたりの分析種の相対レベルを計算する)としての使用に加えて、サンプル中のタンパク質レベルは、それ自体が目的の出力になることもあります。例えば、食物資源1や尿2のタンパク質レベルに関心を持つことができます。サンプル3のタンパク質濃度の測定には、UV吸光度の直接測定4、タンパク質-銅キレート化5,6、タンパク質-色素結合比色アッセイ7、タンパク質-色素結合蛍光アッセイ8など、多くの方法があります。タンパク質定量の関連性は、最も引用された文献9,10のトップ3にタンパク質測定法5,7を説明する2つの論文が存在することによって証明されています。多くの著者が、一次文献以外の文献を引用したり、何も引用しなかったりして、実際の引用を無視しているという事実にもかかわらず、Lowryタンパク質アッセイとブラッドフォードタンパク質アッセイを記述した元の論文は、それぞれ200,000>引用されています10。
ブラッドフォードアッセイの人気は、その手頃な価格、シンプルさ、スピード、感度に起因しています。このアッセイは、酸性条件下でのタンパク質と色素Coomassie Brilliant Blue Gとの相互作用に基づいています。アッセイの条件下(すなわち、低pH)では、色素は3つの形態で存在します:470 nmでλmaxを有する赤色のカチオン型。650 nmにλmaxを有する緑色の中性体。λmaxが590 nm11,12の青色アニオン型です(図1)。カチオン型は、タンパク質の非存在下で優勢である。タンパク質が色素と相互作用すると、青色の陰イオン性形態が安定化し、溶液の色が茶色がかった色から青色に顕著な変化が生じます。通常、青色の色素の濃度の変化は分光光度法で定量化され、その590〜595nmでの吸光度はアッセイ中のタンパク質の量に比例します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65547/65547fig01v2.jpg"> 図1:ブラッドフォードアッセイの条件下でのクマシーブリリアントブルーG吸収スペクトル。 3 つの主要なピークには、赤色(470 nm)、緑色(650 nm)、青色(590 nm)の色素の λmax を示す矢印が付いています。スペクトルは、タンパク質の非存在下(黄色の線)および3 μg(灰色の線)および10 μg(青の線)のウシ血清アルブミンの存在下で記録されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65547/65547fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
ブラッドフォードアッセイの広範な使用は、いくつかの制限(例えば、異なるタンパク質に対するさまざまな応答11、脂質13と界面活性剤7による干渉)の特定と、その性能を改善するための修飾の開発(例えば、界面活性剤の添加14,15、アルカリ化14,16、吸光度の比率の使用17)の開発につながった).アッセイ自体の変更に加えて、分析シグナルを捕捉するためのスマートフォンやカメラなどの代替デバイスの使用も説明されています18,19,20。実際、スマートフォンを携帯型化学分析装置として活用する方法の開発は、活発な研究分野です。スマートフォンを使用する動機は、これらのデバイスの手頃な価格、携帯性、使いやすさ、および広範な可用性に起因しています。
この論文では、スマートフォンを分析デバイスとして使用するRGBradfordアッセイ20を使用したタンパク質定量のためのプロトコルを提供します。元のRGBradford公報20とは対照的に、ここでは、色抽出プロセスを合理化する手順が導入されている。これは、無料で入手できるソフトウェアアプリケーションを利用して、マイクロプレート画像の各ウェルから色情報を自動的に抽出し、時間と労力を大幅に節約することを含みます。これは、グラフィックエディタソフトウェアアプリケーション20を用いて、各ウェルから色データを1つずつ手動で取得する以前の方法に代わるものである。最終的には、スマートフォンで撮影したマイクロプレートの写真から抽出したカラーデータを使用して、サンプル中のタンパク質レベルを定量化できます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well flat-bottom polystyrene microtiter plates&#160;</td>
			<td>Jet Biofil, Guangzhou, China</td>
			<td>TCP011096</td>
			<td>Any flat-bottom microplate compativle with optical reading will suffice.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue G</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>B0770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPhone 11</td>
			<td>Apple</td>
			<td>MWM02BR/A</td>
			<td>Can be substituted with other smartphone equiped with a camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPhone 14 Pro</td>
			<td>Apple</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>695017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Redmi Note 9 Pro</td>
			<td>XIAOMI&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S22 Ultra</td>
			<td>Samsung&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax 384 Plus. Microplate reader.</td>
			<td>Molecular Devices, San Jose, CA</td>
			<td>PLUS 384</td>
			<td>Any microplate reader capable of reading at 450 nm and 590 nm will work. This is optional. The method was actually created to dismiss the need of a microplate reader.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rgbradford: protein quantitation with a smartphone camera

タンパク質の定量は、ライフサイエンス研究において不可欠な手順です。他のいくつかの方法の中でも、ブラッドフォードアッセイは最も使用されている方法の1つです。ブラッドフォードアッセイは広く普及しているため、その性能を向上させるための元の方法のいくつかの変更を含め、限界と利点が徹底的に報告されています。元の方法の変更点の1つは、分析機器としてスマートフォンのカメラを使用することです。この論文では、ブラッドフォードアッセイの条件に存在する3種類のクマシーブリリアントブルー色素を利用して、マイクロプレートの1枚の写真から抽出したカラーデータを使用して、サンプル中のタンパク質を正確に定量する方法について説明します。マイクロプレートでアッセイを行った後、スマートフォンのカメラで写真を撮影し、その画像から無料のオープンソースの画像解析ソフトウェアアプリケーションを使用してRGBカラーデータを抽出します。次に、タンパク質濃度が不明なサンプルの青と緑の強度の比率(RGBスケール)を使用して、標準曲線に基づいてタンパク質含有量を計算します。RGBカラーデータを用いて計算した値と従来の吸光度データを用いて計算した値との間に有意差は認められなかった。

Regardless of the downstream use (e.g., ELISA, enzyme kinetics, western blotting, protein purification, and mass spectrometry), protein quantification is crucial for accurate analysis in life sciences laboratories. In addition to their use as secondary readouts (i.e., to calculate relative levels of analytes per mass of protein), protein levels in a sample can also be the desired output itself. For example, one can be interested in protein levels in food resources1 or in urine2. There are many methods available to measure protein concentration in samples3, including direct UV absorbance readings4, protein-copper chelation5,6, protein-dye binding colorimetric assays7, and protein-dye binding fluorescent assays8. The relevance of protein quantitation is evidenced by the presence of two papers describing protein measurement methods5,7 in the top-3 of the most cited literature9,10. Despite the fact that many authors neglect their actual citation by citing non-primary references or not citing anything at all, the original papers describing the Lowry protein assay and the Bradford protein assay amount &#62;200,000 citations each10.
The popularity of the Bradford assay stems from its affordability, simplicity, speed, and sensitivity. The assay is based on the interaction between proteins and the dye Coomassie Brilliant Blue G under acidic conditions. Under the conditions of the assay (i.e., low pH), the dye exists in three forms: a red cationic form with &#955;max at 470 nm; a green neutral form with &#955;max at 650 nm; and a blue anionic form with &#955;max at 590 nm11,12 (Figure 1). The cationic form predominates in the absence of proteins. As proteins interact with the dye, they stabilize the blue anionic form, causing a noticeable change in the color of the solution, from brownish to blue. Usually, the change in the concentration of the blue form of the dye is quantified spectrophotometrically, whose absorbance at 590-595 nm is proportional to the quantity of protein in the assay.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65547/65547fig01v2.jpg" /> 
Figure 1: Coomassie brilliant blue G absorption spectra under the conditions of the Bradford assay. The three main peaks are marked with arrows indicating the &#955;max of the red (470 nm), green (650 nm), and blue (590 nm) forms of the dye. Spectra were recorded in the absence of protein (yellow line) and in the presence of 3 &#181;g (gray line) and 10 &#181;g (blue line) of bovine serum albumin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65547/65547fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
The widespread use of the Bradford assay has led to the identification of several limitations (e.g., variable responses to different proteins11, and interference by lipids13 and detergents7) and the development of modifications to improve its performance (e.g., the addition of detergents14,15, alkalinization14,16 and use of the ratio of absorbances17). In addition to modifications in the assay itself, the use of alternative devices, such as smartphones or cameras, to capture analytical signals have also been described18,19,20. Indeed, the development of methods that make use of smartphones as portable chemical analyzers has been an active area of research. The motivation for the use of smartphones stems from the affordability, portability, ease of use, and widespread availability of these devices.
This paper provides a protocol for protein quantification using the RGBradford assay20, which uses a smartphone as an analytical device. In contrast to the original RGBradford publication20, here, a procedure that streamlines the color extraction process has been introduced. It involves the utilization of a freely available software application to extract color information from each well of a microplate picture automatically, saving significant time and effort. This is an alternative to the previous method of manually acquiring color data from each well one by one using a graphics editor software application20. Ultimately, protein levels in samples can be quantified using color data extracted from a picture of a microplate taken with a smartphone.

著者スポットライト:スマートフォンを使用したBradford Assayによるタンパク質定量への代替アプローチ(英語) 

RGBradford:スマートフォンカメラによるタンパク質定量(英語)

Our research focuses on understanding at the biochemical level how animals adapt to extreme environmental conditions. We explore questions about their response to lack of oxygen and suppression of metabolic rate. Specifically, we investigate endogenous antioxidants, oxidative stress, and cellularity stress response animals employ in a adverse environment.And to do so, we often quantify protein levels in our samples. This protocol addresses the need for an alternative method to obtain protein quantification data when resource are limited, making it a valuable tool in both educational and research contexts. The RG Bradford Assay offers a practical and reliable solution for protein concentration measurement that is accessible, simple, and accurate in scenarios where conventional equipment such as a microplate reader may be unavailable.

図4は、カラーデータを抽出したマイクロプレートの写真で、450nmと590nmの吸光度を記録しました。ここで代表として報告されたRGBカラーデータは、セクション5で説明したように自動的に取得されました。カラーデータの典型的なパターンは、青の値が増加し、赤と緑の値が減少することです(図5)。すべてのウェルで明らかな反射があり、マイクロ?...

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この論文では、ブラッドフォードアッセイとスマートフォンを分析デバイスとして使用したタンパク質定量のためのプロトコルを提供します。サンプル中のタンパク質レベルは、スマートフォンで撮影したマイクロプレートの写真から抽出したカラーデータを使用して定量化できます。

Protein quantitation is an essential procedure in life sciences research. Amongst several other methods, the Bradford assay is one of the most used. ...

私たちの研究は、動物が極限環境条件にどのように適応するかを生化学レベルで理解することに焦点を当てています。酸素欠乏や代謝率の抑制に対する反応について、疑問を探ります。具体的には、動物の内因性抗酸化物質、酸化ストレス、細胞性ストレス応答について研究しています。そのために、サンプル中のタンパク質レベルを定量化することがよくあります。このプロトコルは、リソースが限られている場合にタンパク質定量データを得るための代替方法の必要性に対処し、教育と研究の両方の文脈で貴重なツールになります。RG Bradford Assayは、マイクロプレートリーダーなどの従来の機器が利用できないシナリオで、アクセスしやすく、シンプルで、正確なタンパク質濃度測定のための実用的で信頼性の高いソリューションを提供します。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

RGBradford: Protein Quantitation with a Smartphone Camera

1.8K ビュー.  University of Brasilia. 私たちの研究は、動物が極限環境条件にどのように適応するかを生化学レベルで理解することに焦点を当てています。酸素欠乏や代謝率の抑制に対する反応について、疑問を探ります。具体的には、動物の内因性抗酸化物質、酸化ストレス、細胞性ストレス応答について研究しています。そのために、サンプル中のタンパク質レベルを定量化することがよくありま?...

ビデオ: 著者スポットライト:スマートフォンを使用したBradford Assayによるタンパク質定量への代替アプローチ(英語) 

Protein quantitation is an essential procedure in life sciences research. Amongst several other methods, the Bradford assay is one of the most used. Because of its widespread, the limitations and advantages of the Bradford assay have been exhaustively reported, including several modifications of the original method to improve its performance. One of the alterations of the original method is the use of a smartphone camera as an analytical instrument. Taking advantage of the three forms of the Coomassie Brilliant Blue dye that exist in the conditions of the Bradford assay, this paper describes how to accurately quantify protein in samples using color data extracted from a single picture of a microplate. After performing the assay in a microplate, a picture is taken using a smartphone camera, and RGB color data is extracted from the picture using a free and open-source image analysis software application. Then, the ratio of blue to green intensity (in the RGB scale) of samples with unknown concentrations of protein is used to calculate the protein content based on a standard curve. No significant difference is observed between values calculated using RGB color data and those calculated using conventional absorbance data.

This paper provides a protocol for protein quantification using the Bradford assay and a smartphone as an analytical device. Protein levels in samples can be quantified using color data extracted from a picture of a microplate taken with a smartphone.

生化学

Recording Bradford Protein Assay Results Using a Smartphone Camera

To begin sample preparation for the Bradford protein assay, dilute the protein samples to obtain protein concentrations within the standard curve range of 0.025 to 1.0 milligrams per milliliter. Create multiple sample dilutions per sample within this range. For the zero protein point, add 10 microliters of the buffer or medium used to prepare the standard solutions to the designated wells.Then add 10 microliters of each protein standard solution into a set of three wells serving as triplicates in a 96-well microplate. In a separate set of wells on the same 96-well microplate, add 10 microliters of each sample dilution in triplicates. Next, add 250 microliters of Bradford protein assay reagent to all wells.A layout of the final microplate setup is displayed on the screen. Proceed to record the results in a well illuminated room within 5 to 15 minutes of adding the assay reagent. Using one hand, hold the microplate against a uniform white background, ensuring it is parallel to the work bench.While using the other hand, hold a smartphone parallel to the bench and the microplate. Proceed to capture several pictures of the entire microplate. For iOS devices, enable the grid option in camera settings to turn on the camera level indicator.For Android devices, activate grid lines in camera settings to achieve the same. Although no special lighting apparatus is required, maintain caution while capturing the images properly. Avoid shading the plate or the background and prevent excessive reflection.Also, ensure not to tilt the plate. Inspect the picture for background, uniformity, shadows, and reflections. Also check the angle of the wells:The center of each well should be directly visible If desired, read the microplate in a microplate reader to compare the picture color data with the microplate absorbance readings.

スマートフォンのカメラを使用したBradford Protein Assay結果の記録

Automatically Extracting the Bradford Assay Data Recorded with a Smartphone

To extract the Bradford Assay data from the images of the microplate recorded using the smartphone camera, download the software image J and the ReadPlate plugin available as a text file. After opening image J, click on Plugins followed by Install, and select the downloaded ReadPlate plugin text file. Set the measurement parameters by clicking on Analyze, and then Set Measurements and checking the options:Area, Standard deviation, Minimum and maximum gray value, Mean gray value, Modal gray value.On the bottom of the window, set Redirect to as None and Decimal place as zero to 9 as 3. Go to File. Click Open and select the picture of the microplate taken using the smartphone.Go to Plugins followed by ReadPlate. Read the instructions and then click OK.Select the Number of wells as 96. Using the rectangular selection tool automatically loaded by the plugin, make a rectangle beginning in the center of the A1 well and ending in the center of the H12 well, then click OK.Select the Blue channel and click OK.Then confirm the default parameters by clicking on OK.Check if the software delineated an area inside each well, and if the selected areas are not covering areas with abnormal shadows or reflection.Once checked, click OK.Save the results before repeating the same for the Green channel. Calculate the Blue to-Green ratio using the mode for each color. The RGB color data obtained automatically from the picture of a microplate showed the typical increase in the blue values and a decrease in the red and green values for the BSA standard.Further, the color data extracted from the picture accurately reflected absorbance readings recorded at 450 and 590 nanometers. The standard curve obtained with the extracted color data depicting the signal versus BSA concentration was found to be linear as expected. A linear relationship between sample dilution and the signal was obtained for both absorbance readings as well as the extracted color data in two different protein samples.For both protein samples, some of the dilutions were not within the linear range of the standard curve. However, after ignoring those points, protein levels calculated using RGB data for both samples matched those calculated using the absorbance readings.

スマートフォンで記録したブラッドフォードアッセイデータの自動抽出

Manually Extracting the Bradford Assay Data Recorded with a Smartphone

To manually extract the Bradford Assay data from the images of the microplate recorded using the smartphone camera, download Inkscape, a free and open source graphics editor. Open Inkscape, go to file, and click open"to select the picture of the microplate taken using the smartphone. Pick the select and transform objects S tool, which is depicted as an arrow on the top left side, and click on the picture.A dashed line border will indicate the selection. Then select the pick colors from Image D tool, which is depicted as an eyedropper on the left side. Next, click in the center of a well.The color on the bottom panel, fill, will change accordingly. Click on the color and a fill and stroke tab will pop up on the right side. Change the flat color dropdown menu to RGB.Record the values shown for the blue and green channels for each well. Calculate the blue to green ratio using the recorded values.